1. MW ) 22 kDa został opisany jako posiadający lepszą zdolność do indukowania transferu genu w porównaniu z jego formą rozgałęzioną. Jednak wydajności transfekcji polimeru nie można zwiększyć poza pewną granicę ze względu na cytotoksyczność. Zbadaliśmy potencjał wykorzystania LPEI o  MW w zakresie od 1,0 do 9,5 kDa w celu przezwyciężenia tego ograniczenia.
  2. Za pomocą cytometrii przepływowej porównano polipleksy plazmidowego DNA kodujące białko wzmocnionej zielonej fluorescencji (EGFP) i różne LPEI pod kątem ich wydajności transfekcji i cytotoksyczności w komórkach CHO-K1 i HeLa. Zaangażowanie endolizosomów w transfer genów za pośrednictwem LPEI badano, stosując inhibitor pompy protonowej, bafilomycynę A1 i sacharozę jako środek lizosomotropowy. Zastosowano konfokalną laserową mikroskopię skaningową do oceny wielkości i kształtu polipleksów w warunkach hodowli komórkowej, wykrywania ich lokalizacji endolizosomalnej oraz obserwacji ich translokacji do jądra komórkowego.
  3. Wydajność transfekcji można zmienić, zmieniając MW  i ilość polimeru dostępnego do tworzenia polipleksu. Największą wydajność transfekcji (około 44%), czyli frakcję komórek EGFP-dodatnich, uzyskano przy LPEI 5,6 kDa, natomiast cytotoksyczność pozostała niska. Zaobserwowano kolokalizację polipleksów i endolizosomów i okazało się, że większe polipleksy szczególnie szybko uciekały z kwaśnych organelli. Dla LPEI 5,0 i 9,0 kDa liczba komórek i jąder, które pobrały DNA po 6 godzinach, była podobna, jak określono metodą cytometrii przepływowej.
  4. Nasze badanie sugeruje, że LPEI o niskich  MW  są obiecującymi kandydatami do niewirusowego dostarczania genów, ponieważ są bardziej wydajne i znacznie mniej toksyczne niż ich odpowiedniki o wyższej  MW  .

Opłacalna transfekcja genów przez kompaktowanie DNA w pH 4,0 przy użyciu zakwaszonej  polietylenoiminy o długim okresie trwałości .

  1. Wprowadzenie materiału genetycznego do komórek jest niezbędnym warunkiem aktualnych badań w biologii molekularnej komórki. Chociaż transfekcja dostępnymi w handlu odczynnikami skutkuje doskonałą ekspresją genów, ich wysokie koszty są przeszkodą w eksperymentowaniu z dużą liczbą lub dużą skalą transfekcji.
  2. Polimer kationowy  liniowy – polietylenoimina  ( MW  25 000) (PEI), jeden z najbardziej opłacalnych nośników, ułatwia kompaktowanie DNA poprzez tworzenie polipleksów, co prowadzi do wydajnego dostarczania DNA do komórek na drodze endocytozy. Jednak zastosowanie PEI jest nadal ograniczone z powodu znacznej cytotoksyczności i niedopuszczalnego pogorszenia wydajności transfekcji ze względu na jej niską stabilność. Tutaj pokazujemy, że zakwaszenie PEI jest ważne dla jej aktywności transfekcyjnej.
  3. Rozpuszczenie proszku PEI w 0,2N HCl zapewnia długi okres trwałości do przechowywania PEI w temperaturze 4 i -80 stopni C, a tworzenie polipleksu plazmidowego DNA z PEI jest zoptymalizowane w soli fizjologicznej buforowanej mleczanem przy pH 4,0.
  4. Ponadto zmiana pożywki hodowlanej 8-12 godzin po transfekcji może zminimalizować cytotoksyczność PEI bez poświęcania wysokiej wydajności transfekcji porównywalnej z wydajnością odczynników handlowych.
  5. Koszt testu z użyciem zakwaszonego PEI jest drastycznie obniżony do około 1:10 000 w porównaniu z odczynnikami komercyjnymi. Zatem wnioskujemy, że zakwaszenie PEI w sposób zadowalający zapewnia opłacalną, wysokowydajną transfekcję.

Test immunoenzymatyczny mikroprzepływowy z zastosowaniem mikroczipa krzemowego z unieruchomionymi przeciwciałami i detekcją chemiluminescencji.

  1. Mikrochipy krzemowe z unieruchomionymi przeciwciałami zostały wykorzystane do opracowania mikroprzepływowych testów immunologicznych enzymatycznych z zastosowaniem detekcji chemiluminescencji i peroksydazy chrzanowej (HRP) jako znacznika enzymu. Poliklonalne przeciwciała anty-atrazynowe sprzężono z powierzchnią mikroczipa krzemowego o całkowitym wymiarze 13,1 x 3,2 mm, zawierającą 42 porowate kanały przepływowe o głębokości 235 mikrometrów i szerokości 25 mikrometrów.
  2. Różne protokoły immobilizacji oparte na kowalencyjnej lub niekowalencyjnej modyfikacji powierzchni krzemionki 3-aminopropylotrietoksysilanem (APTES) lub 3-glicydoksypropylotrimetoksysilanem (GOPS), liniową  polietylenoiminą  (LPEI,  masa cząsteczkowa  750 000) lub rozgałęzioną  polietylenoiminą  (BPEI,  masa cząsteczkowa  25 000), a następnie adsorpcją lub kowalencyjne przyłączenie przeciwciała, oceniano w celu osiągnięcia najlepszej możliwości ponownego użycia, stabilności i czułości mikroprzepływowego testu immunoenzymatycznego (microFEIA).
  3. Adsorpcja przeciwciał na powierzchni krzemionki zmodyfikowanej LPEI i kowalencyjne przyłączenie do fizycznie zaadsorbowanego BPEI prowadzi do niestabilnych powłok przeciwciał. Kowalencyjne sprzężenie przeciwciał przez aldehyd glutarowy (GA) z trzema różnymi funkcjonalizowanymi powierzchniami krzemionki (APTES-GA, LPEI-GA i GOPS-BPEI-GA) dało powłoki przeciwciał, które można było całkowicie zregenerować przy użyciu 0,4 M glicyny/HCl, pH 2,2.
  4. Wykazano, że kompozycja buforowa ma dramatyczny wpływ na stabilność testu, gdzie powszechnie stosowana sól fizjologiczna buforowana fosforanami okazała się najmniej odpowiednim wyborem.
  5. Najlepszą długoterminową stabilność uzyskano dla powierzchni LPEI-GA bez utraty aktywności przeciwciał w ciągu jednego miesiąca. Granice wykrywalności w microFEIA dla trzech różnych powierzchni immunologicznych wynosiły 45, 3,8 i 0,80 ng/l (209, 17,7 i 3,7 pM) odpowiednio dla APTES-GA, LPEI-GA i GOPS-BPEI-GA.

Dostarczanie genów oparte na folianie-PEG-folianie-przeszczepie- polietylenoiminie .

  1. Folian-glikol polietylenowy-folian szczepiony polietylenoiminą  (FPF-g-PEI) zsyntetyzowano przez połączenie kwasu foliowego z obydwoma końcami jednofunkcyjnego PEG, a następnie szczepienie na PEI. Stosunek szczepienia określono stosując prawo Beera, mierząc absorbancję UV przy 363 nm.
  2. Określono profil pH, średnicę i kształt nośników. Wydajność transfekcji została zoptymalizowana w normalnych komórkach mięśni gładkich (SMC) i komórkach gruczolakoraka okrężnicy CT-26 przy użyciu plazmidowego DNA kodującego gen reporterowy lucyferazy. Wykazano, że wolny kwas foliowy hamuje transfekcję z FPF-2,3 g-PEI przy obojętnym stosunku ładunku.
  3. Toksyczność względną pomiędzy PEI a zmodyfikowanym nośnikiem mierzono za pomocą testu kolorymetrycznego MTT. Potencjał terapeutyczny pmIFN-gamma skompleksowanego z tymi nośnikami polimerowymi pod względem ekspresji genów określono na poziomie białka i mRNA za pomocą ELISA i RT-PCR. Stwierdzono, że FPF-g-PEI ma liniowe polimery 2,3 folan-PEG-folian (FPF)   wszczepione do każdej cząsteczki PEI.
  4. Zmierzona średnia masa cząsteczkowa wynosiła około 33500  Mw  , a profil pH był charakterystyczny dla zdolności do rozrywania endosomów. Mikroskopia sił atomowych (AFM) i dynamiczne rozpraszanie światła laserowego (DLLS) wykazały, że FPF-2,3 g-PEI i PEI (w stosunku wagowym 2) skutecznie skondensowany plazmid
  5. DNA dające polipleksy sferoidalne o średniej średnicy około 150 nm. FPF-2,3 g-PEI przewyższał PEI pod względem cytotoksyczności i wydajności transfekcji w komórkach nowotworowych. Komórki mięśni gładkich nie wykazywały swoistości wobec kompleksów kwasu foliowego na uwięzi, gdzie kompleksy PEI/pLuc dawały wyższą wydajność.

Preparaty na bazie polietylenoiminy do dostarczania oligonukleotydów.

  • Polietylenoimina  (PEI) jest dobrze znana jako niewirusowy wektor do dostarczania genów, zwłaszcza do dostarczania oligonukleotydów. Jednak jego zastosowania kliniczne są znacznie ograniczone ze względu na wysoki ładunek kationowy, niskie rozpoznawanie komórek oraz oddziaływanie z białkami i komórkami niedocelowymi w płynach biologicznych, co skutkuje wysoką cytotoksycznością, słabą stabilnością i niską wydajnością transfekcji w transporcie oligonukleotydów.
  • Wielu badaczy stwierdziło, że masa cząsteczkowa ( MW ) PEI, stopień rozgałęzionej lub  liniowej  struktury, stosunek N/P, pojemność buforowa, struktura oligonukleotydów, pH pożywki hodowlanej, surowica i różne typy cząstek opartych na PEI, w tym metody przygotowania, powodują duża różnica w toksyczności komórkowej, stabilności, wydajności transfekcji dla systemów dostarczania oligonukleotydów opartych na PEI.
  • Ligandy, małe cząsteczki, peptydy ukierunkowane na sprzęganie, hydrofobowe, hydrofilowe i amfifilowe modyfikacje PEI są również dokładnie badane w celu zmniejszenia toksyczności komórkowej i poprawy stabilności, wydajności transfekcji i efektu terapeutycznego.
  • Co więcej, różne inteligentne modyfikacje PEI, takie jak wiązanie reagujące na pH (wiązanie hydrazonowe) i wiązanie wrażliwe na reakcję redoks (wiązanie disiarczkowe) mogą dokładnie kontrolować uwalnianie oligonukleotydów i przyciągnęły uwagę w zakresie wydajnego dostarczania oligonukleotydów.

Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 10,000)

PEG-10K Alpha Diagnostics 100 mg 225 EUR

Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 5,000)

PEG-5K Alpha Diagnostics 100 mg 225 EUR

Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 20,000)

PEGM-20K Alpha Diagnostics 100 mg 225 EUR

Methoxy PEG Carboxy Acetic Acid (MW: 5000-linear)

PEG-05K-COH Alpha Diagnostics 100 mg 164 EUR

Chlorotoxin(linear)

HY-P0173 MedChemExpress 25mg 1910 EUR

Anantin (linear sequence)

5-00672 CHI Scientific 4 x 1mg Ask for price

Anantin (linear sequence)

H-8140.0001 Bachem 1.0mg 576 EUR

Anantin (linear sequence)

H-8140.0005 Bachem 5.0mg 2207 EUR

Rainbow Linear Calibration Particles

RLP-30-5 Spherotech 5 mL 314 EUR

Linear Kinetoplast DNA Marker

TG2018-1 TopoGen 10 ug 179 EUR

Linear pRYG DNA Marker

TG2028-1 TopoGen 10 ug 179 EUR

Linear Polyacrylamide (5mg/ml)

S143 GeneOn 1 ml 40 EUR

AXYPREP MAG DYECLEAN KIT- 250 ML - 25000 PREPS.

MAG-DYECL-250 CORNING 1/pk 4182 EUR

Rat Monoclonal Anti-Dinitrophenyl (DNP) IgG1, aff pure (w/o azide)

DNP15-MW Alpha Diagnostics 100 ug 445 EUR

UNIVERSAL LINEAR 4 PLACE STAND

AP-USD4 CORNING 1/pk 70 EUR

Human recombinant linear di-ubiquitin

6424-100 Biovision 289 EUR

Human recombinant linear tri-ubiquitin

6425-100 Biovision 289 EUR

Human recombinant linear tetra-ubiquitin

6426-100 Biovision 289 EUR

Human recombinant linear penta-ubiquitin

6427-100 Biovision 289 EUR

Linear Poly Acrylamide Solution (5mg/ml)

LK548 Bio Basic 1ml 63.05 EUR

UNIVERSAL LINEAR RACK FOR SIX PIPETTES

4079 CORNING 1/pk 70 EUR

mPEG-BSA (Molecular Weight: 5,000-linear)

PEG-BSA-05K Alpha Diagnostics 100 ug 286 EUR

mPEG-BSA (Molecular Weight: 10,000-linear)

PEG-BSA-10K Alpha Diagnostics 100 ug 286 EUR

mPEG-BSA (Molecular Weight: 20,000-linear)

PEG-BSA-20K Alpha Diagnostics 100 ug 286 EUR

mPEG-BSA (Molecular Weight: 40,000-linear)

PEG-BSA-40K Alpha Diagnostics 100 ug 286 EUR

MW-150

HY-120111 MedChemExpress 10mM/1mL 492 EUR

2K Plus DNA Marker (8 linear double-stranded DNA bands)

20-abx098046 Abbexa
  • 258.00 EUR
  • 189.00 EUR
  • 2.5 ml
  • 500 ul

2K Plus DNA Marker (9 linear double-stranded DNA bands)

20-abx098047 Abbexa
  • 258.00 EUR
  • 189.00 EUR
  • 2.5 ml
  • 500 ul

100bp Plus DNA Marker (12 linear double-stranded DNA bands)

20-abx098053 Abbexa
  • 272.00 EUR
  • 189.00 EUR
  • 2.5 ml
  • 500 ul

100bp Plus DNA Marker (14 linear double-stranded DNA bands)

20-abx098054 Abbexa
  • 300.00 EUR
  • 203.00 EUR
  • 2.5 ml
  • 500 ul

MW-150 dihydrochloride dihydrate

HY-120111B MedChemExpress 10mg 681 EUR

Topoisomerase IIα MW Marker

TG2011-3 TopoGen 20 units 436 EUR

mPEG-Biotinylated (MW: 5000)

PEG-BTN Alpha Diagnostics 1 mg 347 EUR

Urokinase protein (Low MW)

30C-CP4014 Fitzgerald 3 KU 89 EUR

Lys-Lys-Lys (MW: 402.53)

SP-101947-10 Alpha Diagnostics 10 mg 164 EUR

Lys-Lys-Dihydrochloride (MW: 347.28)

SP-101950-50 Alpha Diagnostics 50 mg 164 EUR

SRPX2 Antibody

25000-100ul SAB 100ul 390 EUR

5-Aminovaleric acid hydrochloride

A1935-25000 ApexBio 25 g 212 EUR

Agarose GPG/LMP low melt

A2501-25000 ApexBio 25 g 154 EUR

Daminozide

A3348-25000 ApexBio 25 g 125 EUR

Carvedilol

B1332-25000 ApexBio 25 g 435 EUR

Isoprenaline HCl

B1336-25000 ApexBio 25 g 171 EUR

Dehydroepiandrosterone (DHEA)

B1375-25000 ApexBio 25 g 279 EUR

Pregnenolone

B1512-25000 ApexBio 25 g 147 EUR

Hexamethonium Bromide

B1592-25000 ApexBio 25 g 116 EUR

Fenspiride HCl

B1754-25000 ApexBio 25 g 255 EUR

Sulfadoxine

B1841-25000 ApexBio 25 g 221 EUR

Sulfamethoxypyridazine

B1843-25000 ApexBio 25 g 154 EUR

Hydrochlorothiazide

B1950-25000 ApexBio 25000 mg 142 EUR

Piracetam

B2006-25000 ApexBio 25 g 203 EUR

Sparfloxacin

B2030-25000 ApexBio 25 g 398 EUR

Tempol

B2046-25000 ApexBio 25 g 282 EUR

Zidovudine

B2221-25000 ApexBio 25 g 154 EUR

3-Indolebutyric acid (IBA)

B5985-25000 ApexBio 25 g 131 EUR

Oxolinic acid

B6129-25000 ApexBio 25 g 398 EUR

Diflunisal

B6137-25000 ApexBio 25 g 270 EUR

(+/-)-Sulfinpyrazone

B6139-25000 ApexBio 25 g 267 EUR

Cinnarizine

B6156-25000 ApexBio 25 g 147 EUR

Perphenazine

B6157-25000 ApexBio 25 g 615 EUR

2-Hydroxypropyl-?-cyclodextrin

B6413-25000 ApexBio 25 g 180 EUR

Rink Amide Resin

A6576-25000 ApexBio 25 g 299 EUR

2 CTC

A6577-25000 ApexBio 25 g 171 EUR

Fmoc-Tyr(tBu)-ol

A6579-25000 ApexBio 25 g 1442 EUR

Z-Thr-ol

A6581-25000 ApexBio 25 g 490 EUR

Fmoc-D-Thr-ol

A6582-25000 ApexBio 25 g 827 EUR

D-Thr-ol

A6583-25000 ApexBio 25 g 1094 EUR

Fmoc-Thr(tBu)-ol

A6584-25000 ApexBio 25 g 1005 EUR

DL-Dithiothreitol

B7294-25000 ApexBio 25 g 299 EUR

Acridine Orange hydrochloride

B7747-25000 ApexBio 25 g 286 EUR

3-Bromopyruvic acid

B7922-25000 ApexBio 25 g 235 EUR

H-Asp(OMe)-OtBu. HCl

B8224-25000 ApexBio 25 g 1326 EUR

L-Alanyl-L-Glutamine

B8228-25000 ApexBio 25 g 157 EUR

(R,S)-Atenolol

C5286-25000 ApexBio 25 g 369 EUR

Ciprofloxacin (hydrochloride)

C5539-25000 ApexBio 25 g 154 EUR

1-Benzylimidazole

C5689-25000 ApexBio 25 g 293 EUR

(S)-Naproxen

C5755-25000 ApexBio 25 g 174 EUR

Inosine-5'-monophosphate (sodium salt hydrate)

C4671-25000 ApexBio 25 g 137 EUR

Tolmetin (sodium salt hydrate)

C4720-25000 ApexBio 25 g 528 EUR

Spermine

C4910-25000 ApexBio 25 g 659 EUR

Uniconazole

C5076-25000 ApexBio 25 g 266 EUR

Umbelliferone

N2282-25000 ApexBio 25 g 125 EUR

Ethyl 3-Aminobenzoate (methanesulfonate)

C3619-25000 ApexBio 25 g 128 EUR

Dimethyl DL-Glutamate (hydrochloride)

C3762-25000 ApexBio 25 g 395 EUR

Kanamycin A

C3795-25000 ApexBio 25 g 329 EUR

Hemin chloride

C3984-25000 ApexBio 25 g 441 EUR

H-Thr(Bzl)-ol

A6585-25000 ApexBio 25 g 931 EUR

Fmoc-Ser(tBu)-ol

A6586-25000 ApexBio 25 g 815 EUR

L-Ser(Bzl)-ol

A6588-25000 ApexBio 25 g 931 EUR

D-Phe-Ol

A6589-25000 ApexBio 25 g 212 EUR

D-Met-ol

A6590-25000 ApexBio 25 g 904 EUR

Fmoc-Lys(Boc)-ol

A6591-25000 ApexBio 25 g 722 EUR

Boc-Lys(2-Cl-Z)-ol

A6592-25000 ApexBio 25 g 815 EUR

Fmoc-Leu-ol

A6593-25000 ApexBio 25 g 424 EUR

D-Leu-ol

A6594-25000 ApexBio 25 g 514 EUR

Fmoc-Ile-ol

A6595-25000 ApexBio 25 g 717 EUR

Boc-His(Tos)-ol

A6596-25000 ApexBio 25 g 630 EUR

Fmoc-Glu-ol

A6598-25000 ApexBio 25 g 722 EUR

Fmoc-Cys(Trt)-ol

A6600-25000 ApexBio 25 g 746 EUR

Fmoc-Cys(Acm)-ol

A6601-25000 ApexBio 25 g 1210 EUR

Boc-D-Cys(pMeBzl)-ol

A6602-25000 ApexBio 25 g 1442 EUR

 

Ogólnie rzecz biorąc, wydajne dostarczanie oligonukleotydów można osiągnąć dzięki różnym modyfikacjom PEI ze zoptymalizowanymi parametrami preparatów opartych na PEI lub PEI.