1. MW ) 22 kDa został opisany jako posiadający lepszą zdolność do indukowania transferu genu w porównaniu z jego formą rozgałęzioną. Jednak wydajności transfekcji polimeru nie można zwiększyć poza pewną granicę ze względu na cytotoksyczność. Zbadaliśmy potencjał wykorzystania LPEI o  MW w zakresie od 1,0 do 9,5 kDa w celu przezwyciężenia tego ograniczenia.
  2. Za pomocą cytometrii przepływowej porównano polipleksy plazmidowego DNA kodujące białko wzmocnionej zielonej fluorescencji (EGFP) i różne LPEI pod kątem ich wydajności transfekcji i cytotoksyczności w komórkach CHO-K1 i HeLa. Zaangażowanie endolizosomów w transfer genów za pośrednictwem LPEI badano, stosując inhibitor pompy protonowej, bafilomycynę A1 i sacharozę jako środek lizosomotropowy. Zastosowano konfokalną laserową mikroskopię skaningową do oceny wielkości i kształtu polipleksów w warunkach hodowli komórkowej, wykrywania ich lokalizacji endolizosomalnej oraz obserwacji ich translokacji do jądra komórkowego.
  3. Wydajność transfekcji można zmienić, zmieniając MW  i ilość polimeru dostępnego do tworzenia polipleksu. Największą wydajność transfekcji (około 44%), czyli frakcję komórek EGFP-dodatnich, uzyskano przy LPEI 5,6 kDa, natomiast cytotoksyczność pozostała niska. Zaobserwowano kolokalizację polipleksów i endolizosomów i okazało się, że większe polipleksy szczególnie szybko uciekały z kwaśnych organelli. Dla LPEI 5,0 i 9,0 kDa liczba komórek i jąder, które pobrały DNA po 6 godzinach, była podobna, jak określono metodą cytometrii przepływowej.
  4. Nasze badanie sugeruje, że LPEI o niskich  MW  są obiecującymi kandydatami do niewirusowego dostarczania genów, ponieważ są bardziej wydajne i znacznie mniej toksyczne niż ich odpowiedniki o wyższej  MW  .

Opłacalna transfekcja genów przez kompaktowanie DNA w pH 4,0 przy użyciu zakwaszonej  polietylenoiminy o długim okresie trwałości .

  1. Wprowadzenie materiału genetycznego do komórek jest niezbędnym warunkiem aktualnych badań w biologii molekularnej komórki. Chociaż transfekcja dostępnymi w handlu odczynnikami skutkuje doskonałą ekspresją genów, ich wysokie koszty są przeszkodą w eksperymentowaniu z dużą liczbą lub dużą skalą transfekcji.
  2. Polimer kationowy  liniowy – polietylenoimina  ( MW  25 000) (PEI), jeden z najbardziej opłacalnych nośników, ułatwia kompaktowanie DNA poprzez tworzenie polipleksów, co prowadzi do wydajnego dostarczania DNA do komórek na drodze endocytozy. Jednak zastosowanie PEI jest nadal ograniczone z powodu znacznej cytotoksyczności i niedopuszczalnego pogorszenia wydajności transfekcji ze względu na jej niską stabilność. Tutaj pokazujemy, że zakwaszenie PEI jest ważne dla jej aktywności transfekcyjnej.
  3. Rozpuszczenie proszku PEI w 0,2N HCl zapewnia długi okres trwałości do przechowywania PEI w temperaturze 4 i -80 stopni C, a tworzenie polipleksu plazmidowego DNA z PEI jest zoptymalizowane w soli fizjologicznej buforowanej mleczanem przy pH 4,0.
  4. Ponadto zmiana pożywki hodowlanej 8-12 godzin po transfekcji może zminimalizować cytotoksyczność PEI bez poświęcania wysokiej wydajności transfekcji porównywalnej z wydajnością odczynników handlowych.
  5. Koszt testu z użyciem zakwaszonego PEI jest drastycznie obniżony do około 1:10 000 w porównaniu z odczynnikami komercyjnymi. Zatem wnioskujemy, że zakwaszenie PEI w sposób zadowalający zapewnia opłacalną, wysokowydajną transfekcję.

Test immunoenzymatyczny mikroprzepływowy z zastosowaniem mikroczipa krzemowego z unieruchomionymi przeciwciałami i detekcją chemiluminescencji.

  1. Mikrochipy krzemowe z unieruchomionymi przeciwciałami zostały wykorzystane do opracowania mikroprzepływowych testów immunologicznych enzymatycznych z zastosowaniem detekcji chemiluminescencji i peroksydazy chrzanowej (HRP) jako znacznika enzymu. Poliklonalne przeciwciała anty-atrazynowe sprzężono z powierzchnią mikroczipa krzemowego o całkowitym wymiarze 13,1 x 3,2 mm, zawierającą 42 porowate kanały przepływowe o głębokości 235 mikrometrów i szerokości 25 mikrometrów.
  2. Różne protokoły immobilizacji oparte na kowalencyjnej lub niekowalencyjnej modyfikacji powierzchni krzemionki 3-aminopropylotrietoksysilanem (APTES) lub 3-glicydoksypropylotrimetoksysilanem (GOPS), liniową  polietylenoiminą  (LPEI,  masa cząsteczkowa  750 000) lub rozgałęzioną  polietylenoiminą  (BPEI,  masa cząsteczkowa  25 000), a następnie adsorpcją lub kowalencyjne przyłączenie przeciwciała, oceniano w celu osiągnięcia najlepszej możliwości ponownego użycia, stabilności i czułości mikroprzepływowego testu immunoenzymatycznego (microFEIA).
  3. Adsorpcja przeciwciał na powierzchni krzemionki zmodyfikowanej LPEI i kowalencyjne przyłączenie do fizycznie zaadsorbowanego BPEI prowadzi do niestabilnych powłok przeciwciał. Kowalencyjne sprzężenie przeciwciał przez aldehyd glutarowy (GA) z trzema różnymi funkcjonalizowanymi powierzchniami krzemionki (APTES-GA, LPEI-GA i GOPS-BPEI-GA) dało powłoki przeciwciał, które można było całkowicie zregenerować przy użyciu 0,4 M glicyny/HCl, pH 2,2.
  4. Wykazano, że kompozycja buforowa ma dramatyczny wpływ na stabilność testu, gdzie powszechnie stosowana sól fizjologiczna buforowana fosforanami okazała się najmniej odpowiednim wyborem.
  5. Najlepszą długoterminową stabilność uzyskano dla powierzchni LPEI-GA bez utraty aktywności przeciwciał w ciągu jednego miesiąca. Granice wykrywalności w microFEIA dla trzech różnych powierzchni immunologicznych wynosiły 45, 3,8 i 0,80 ng/l (209, 17,7 i 3,7 pM) odpowiednio dla APTES-GA, LPEI-GA i GOPS-BPEI-GA.

Dostarczanie genów oparte na folianie-PEG-folianie-przeszczepie- polietylenoiminie .

  1. Folian-glikol polietylenowy-folian szczepiony polietylenoiminą  (FPF-g-PEI) zsyntetyzowano przez połączenie kwasu foliowego z obydwoma końcami jednofunkcyjnego PEG, a następnie szczepienie na PEI. Stosunek szczepienia określono stosując prawo Beera, mierząc absorbancję UV przy 363 nm.
  2. Określono profil pH, średnicę i kształt nośników. Wydajność transfekcji została zoptymalizowana w normalnych komórkach mięśni gładkich (SMC) i komórkach gruczolakoraka okrężnicy CT-26 przy użyciu plazmidowego DNA kodującego gen reporterowy lucyferazy. Wykazano, że wolny kwas foliowy hamuje transfekcję z FPF-2,3 g-PEI przy obojętnym stosunku ładunku.
  3. Toksyczność względną pomiędzy PEI a zmodyfikowanym nośnikiem mierzono za pomocą testu kolorymetrycznego MTT. Potencjał terapeutyczny pmIFN-gamma skompleksowanego z tymi nośnikami polimerowymi pod względem ekspresji genów określono na poziomie białka i mRNA za pomocą ELISA i RT-PCR. Stwierdzono, że FPF-g-PEI ma liniowe polimery 2,3 folan-PEG-folian (FPF)   wszczepione do każdej cząsteczki PEI.
  4. Zmierzona średnia masa cząsteczkowa wynosiła około 33500  Mw  , a profil pH był charakterystyczny dla zdolności do rozrywania endosomów. Mikroskopia sił atomowych (AFM) i dynamiczne rozpraszanie światła laserowego (DLLS) wykazały, że FPF-2,3 g-PEI i PEI (w stosunku wagowym 2) skutecznie skondensowany plazmid
  5. DNA dające polipleksy sferoidalne o średniej średnicy około 150 nm. FPF-2,3 g-PEI przewyższał PEI pod względem cytotoksyczności i wydajności transfekcji w komórkach nowotworowych. Komórki mięśni gładkich nie wykazywały swoistości wobec kompleksów kwasu foliowego na uwięzi, gdzie kompleksy PEI/pLuc dawały wyższą wydajność.

Preparaty na bazie polietylenoiminy do dostarczania oligonukleotydów.

  • Polietylenoimina  (PEI) jest dobrze znana jako niewirusowy wektor do dostarczania genów, zwłaszcza do dostarczania oligonukleotydów. Jednak jego zastosowania kliniczne są znacznie ograniczone ze względu na wysoki ładunek kationowy, niskie rozpoznawanie komórek oraz oddziaływanie z białkami i komórkami niedocelowymi w płynach biologicznych, co skutkuje wysoką cytotoksycznością, słabą stabilnością i niską wydajnością transfekcji w transporcie oligonukleotydów.
  • Wielu badaczy stwierdziło, że masa cząsteczkowa ( MW ) PEI, stopień rozgałęzionej lub  liniowej  struktury, stosunek N/P, pojemność buforowa, struktura oligonukleotydów, pH pożywki hodowlanej, surowica i różne typy cząstek opartych na PEI, w tym metody przygotowania, powodują duża różnica w toksyczności komórkowej, stabilności, wydajności transfekcji dla systemów dostarczania oligonukleotydów opartych na PEI.
  • Ligandy, małe cząsteczki, peptydy ukierunkowane na sprzęganie, hydrofobowe, hydrofilowe i amfifilowe modyfikacje PEI są również dokładnie badane w celu zmniejszenia toksyczności komórkowej i poprawy stabilności, wydajności transfekcji i efektu terapeutycznego.
  • Co więcej, różne inteligentne modyfikacje PEI, takie jak wiązanie reagujące na pH (wiązanie hydrazonowe) i wiązanie wrażliwe na reakcję redoks (wiązanie disiarczkowe) mogą dokładnie kontrolować uwalnianie oligonukleotydów i przyciągnęły uwagę w zakresie wydajnego dostarczania oligonukleotydów.

Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 10,000)

PEG-10K Alpha Diagnostics 100 mg 270 EUR

Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 5,000)

PEG-5K Alpha Diagnostics 100 mg 270 EUR

Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 20,000)

PEGM-20K Alpha Diagnostics 100 mg 270 EUR

Methoxy PEG Carboxy Acetic Acid (MW: 5000-linear)

PEG-05K-COH Alpha Diagnostics 100 mg 196.8 EUR

Chlorotoxin(linear)

HY-P0173 MedChemExpress 25mg 2292 EUR

Polyethylenimine, 50 % w/v, 100 ML

M-CSS-257 MiTeGen 4 x 25 ml 108 EUR

Anantin (linear sequence)

5-00672 CHI Scientific 4 x 1mg Ask for price

Anantin (linear sequence)

H-8140.0001 Bachem 1.0mg 691.2 EUR

Anantin (linear sequence)

H-8140.0005 Bachem 5.0mg 2648.4 EUR

Sartorius Linear Stand

PIP7678 Scientific Laboratory Supplies EACH 84.36 EUR

AXYPREP MAG DYECLEAN KIT- 250 ML - 25000 PREPS.

MAG-DYECL-250 CORNING 1/pk 5018.4 EUR

Linear Polyacrylamide (5mg/ml)

S143 GeneOn 1 ml 48 EUR

Linear Kinetoplast DNA Marker

TG2018-1 TopoGen 10 ug 214.8 EUR

Linear pRYG DNA Marker

TG2028-1 TopoGen 10 ug 214.8 EUR

Rainbow Linear Calibration Particles

RLP-30-5 Spherotech 5 mL 376.8 EUR

Linear Platform For BAT1100

BAT1102 Scientific Laboratory Supplies EACH 479.94 EUR

IKA Shaker HS501D Linear

SHA2072 Scientific Laboratory Supplies EACH 6135.48 EUR

Rat Monoclonal Anti-Dinitrophenyl (DNP) IgG1, aff pure (w/o azide)

DNP15-MW Alpha Diagnostics 100 ug 534 EUR

Magnetic Wand with rubber grips for SPINE caps

MW-1C MiTeGen 1 WAND 155 EUR

Human recombinant linear di-ubiquitin

6424-100 Biovision 346.8 EUR

Human recombinant linear tri-ubiquitin

6425-100 Biovision 346.8 EUR

Human recombinant linear tetra-ubiquitin

6426-100 Biovision 346.8 EUR

Human recombinant linear penta-ubiquitin

6427-100 Biovision 346.8 EUR

UNIVERSAL LINEAR 4 PLACE STAND

AP-USD4 CORNING 1/pk 84 EUR

UNIVERSAL LINEAR RACK FOR SIX PIPETTES

4079 CORNING 1/pk 84 EUR

Linear Poly Acrylamide Solution (5mg/ml)

LK548 Bio Basic 1ml 75.66 EUR

mPEG-BSA (Molecular Weight: 5,000-linear)

PEG-BSA-05K Alpha Diagnostics 100 ug 343.2 EUR

mPEG-BSA (Molecular Weight: 10,000-linear)

PEG-BSA-10K Alpha Diagnostics 100 ug 343.2 EUR

mPEG-BSA (Molecular Weight: 20,000-linear)

PEG-BSA-20K Alpha Diagnostics 100 ug 343.2 EUR

mPEG-BSA (Molecular Weight: 40,000-linear)

PEG-BSA-40K Alpha Diagnostics 100 ug 343.2 EUR

Nicotinic Acid Linear Set w/ Blank in Cuvs

RSPEC1027 Scientific Laboratory Supplies PK5 2981.1 EUR

MW-150

HY-120111 MedChemExpress 10mM/1mL 590.4 EUR

2K Plus DNA Marker (8 linear double-stranded DNA bands)

20-abx098046 Abbexa
  • 309.60 EUR
  • 226.80 EUR
  • 2.5 ml
  • 500 ul

2K Plus DNA Marker (9 linear double-stranded DNA bands)

20-abx098047 Abbexa
  • 309.60 EUR
  • 226.80 EUR
  • 2.5 ml
  • 500 ul

100bp Plus DNA Marker (12 linear double-stranded DNA bands)

20-abx098053 Abbexa
  • 326.40 EUR
  • 226.80 EUR
  • 2.5 ml
  • 500 ul

100bp Plus DNA Marker (14 linear double-stranded DNA bands)

20-abx098054 Abbexa
  • 360.00 EUR
  • 243.60 EUR
  • 2.5 ml
  • 500 ul

Spectropho Pot Dichro Linear Std Set w/ Blank in Cuvs

RSPEC1022 Scientific Laboratory Supplies PK6 3499.8 EUR

SRPX2 Antibody

25000-100ul SAB 100ul 468 EUR

Agarose GPG/LMP low melt

A2501-25000 ApexBio 25 g 184.8 EUR

Daminozide

A3348-25000 ApexBio 25 g 150 EUR

Sodium Orthovanadate

A8524-25000 ApexBio 25 g 268.8 EUR

Fmoc-Phe-Wang resin

A6831-25000 ApexBio 25 g 246 EUR

Fmoc-Ile-Wang resin

A6836-25000 ApexBio 25 g 246 EUR

Fmoc-Gly-Wang resin

A6839-25000 ApexBio 25 g 246 EUR

Fmoc-Asn(Trt)-Wang resin

A6845-25000 ApexBio 25 g 447.6 EUR

Z-Lys(Z)-OH

A6953-25000 ApexBio 25 g 115.2 EUR

Z-His(Dnp)-OH

A6961-25000 ApexBio 25 g 756 EUR

Boc-ON

A7004-25000 ApexBio 25 g 115.2 EUR

Fmoc-Cl

A7010-25000 ApexBio 25 g 135.6 EUR

BOP reagent

A7015-25000 ApexBio 25 g 135.6 EUR

HATU

A7022-25000 ApexBio 25 g 169.2 EUR

HOAt

A7024-25000 ApexBio 25 g 166.8 EUR

HOOBt

A7026-25000 ApexBio 25 g 127.2 EUR

HCTU

A7027-25000 ApexBio 25 g 174 EUR

PyBOP

A7029-25000 ApexBio 25 g 115.2 EUR

HMP Linker

A7041-25000 ApexBio 25 g 186 EUR

Rink Amide Linker

A7042-25000 ApexBio 25 g 265.2 EUR

Ramage Linker,Fmoc-Suberol

A7043-25000 ApexBio 25 g 282 EUR

DMAP

A7055-25000 ApexBio 25 g 135.6 EUR

5-Ethyltio-1H-Tetrazole

A7058-25000 ApexBio 25 g 160.8 EUR

Tetrazole

A7061-25000 ApexBio 25 g 110.4 EUR

H-D-Ala-OBzl.TosOH

A7070-25000 ApexBio 25 g 278.4 EUR

L-NAME hydrochloride

A7088-25000 ApexBio 25 g 268.8 EUR

H-Cys(Trt)-OH

A7143-25000 ApexBio 25 g 126 EUR

Bz-Glu-OH

A7158-25000 ApexBio 25 g 146.4 EUR

H-Glu(OEt)-OEt.HCl

A7170-25000 ApexBio 25 g 132 EUR

H-Glu(OtBu)-OtBu.HCl

A7175-25000 ApexBio 25 g 271.2 EUR

H-Lys(Ac)-OH.HCl

A7231-25000 ApexBio 25 g 274.8 EUR

H-Lys(Boc)-OH

A7232-25000 ApexBio 25 g 249.6 EUR

H-Lys(Z)-OH

A7237-25000 ApexBio 25 g 94.8 EUR

H-Pro-OtBu

A7281-25000 ApexBio 25 g 278.4 EUR

H-Ser-OBzl.HCl

A7294-25000 ApexBio 25 g 284.4 EUR

H-Ser(Bzl)-OH

A7295-25000 ApexBio 25 g 196.8 EUR

Fmoc-Ala-OMe

A7301-25000 ApexBio 25 g 1062 EUR

Fmoc-Arg-OH

A7306-25000 ApexBio 25 g 169.2 EUR

Fmoc-Arg(Pbf)-OH

A7308-25000 ApexBio 25 g 199.2 EUR

Boc-Asp-OtBu

A7349-25000 ApexBio 25 g 393.6 EUR

Fmoc-Arg(Tos)-OH

A7352-25000 ApexBio 25 g 243.6 EUR

Fmoc-Asn(Trt)-OH

A7357-25000 ApexBio 25 g 111.6 EUR

Fmoc-Asp-OH

A7361-25000 ApexBio 25 g 174 EUR

Fmoc-Asp-OAll

A7362-25000 ApexBio 25 g 904.8 EUR

Fmoc-Asp-OtBu

A7364-25000 ApexBio 25 g 505.2 EUR

H-Ser(tBu)-OBzl.HCl

A7380-25000 ApexBio 25 g 303.6 EUR

H-Val-OtBu.HCl

A7441-25000 ApexBio 25 g 236.4 EUR

Fmoc-Cha-OH

A7460-25000 ApexBio 25 g 622.8 EUR

Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH

A7482-25000 ApexBio 25 g 578.4 EUR

H-Cit-OH

A7486-25000 ApexBio 25 g 110.4 EUR

H-D-Dab-OH.2HCl

A7493-25000 ApexBio 25 g 969.6 EUR

Boc-N-Me-Ala-OH

A7522-25000 ApexBio 25 g 358.8 EUR

Fmoc-N-Me-Asp(OtBu)-OH

A7526-25000 ApexBio 25 g 5613.6 EUR

Fmoc-N-Me-Ile-OH

A7528-25000 ApexBio 25 g 578.4 EUR

H-D-N-Me-Leu-OBzl.TosOH

A7530-25000 ApexBio 25 g 3400.8 EUR

H-Phe(4-F)-OH

A7531-25000 ApexBio 25 g 505.2 EUR

H-D-Phe(2-F)-OH.HCl

A7539-25000 ApexBio 25 g 908.4 EUR

H-HoArg-OH

A7543-25000 ApexBio 25 g 358.8 EUR

Boc-HoArg(NO2)-OH

A7544-25000 ApexBio 25 g 2131.2 EUR

H-HoSer-OH

A7583-25000 ApexBio 25 g 292.8 EUR

Fmoc-Hyp-OH

A7599-25000 ApexBio 25 g 201.6 EUR

H-DL-Nva-OH

A7656-25000 ApexBio 25 g 122.4 EUR

m-NH2-Tyr-OH.2HCl

A7700-25000 ApexBio 25 g 466.8 EUR

 

Ogólnie rzecz biorąc, wydajne dostarczanie oligonukleotydów można osiągnąć dzięki różnym modyfikacjom PEI ze zoptymalizowanymi parametrami preparatów opartych na PEI lub PEI.