- ( MW ) 22 kDa został opisany jako posiadający lepszą zdolność do indukowania transferu genu w porównaniu z jego formą rozgałęzioną. Jednak wydajności transfekcji polimeru nie można zwiększyć poza pewną granicę ze względu na cytotoksyczność. Zbadaliśmy potencjał wykorzystania LPEI o MW w zakresie od 1,0 do 9,5 kDa w celu przezwyciężenia tego ograniczenia.
- Za pomocą cytometrii przepływowej porównano polipleksy plazmidowego DNA kodujące białko wzmocnionej zielonej fluorescencji (EGFP) i różne LPEI pod kątem ich wydajności transfekcji i cytotoksyczności w komórkach CHO-K1 i HeLa. Zaangażowanie endolizosomów w transfer genów za pośrednictwem LPEI badano, stosując inhibitor pompy protonowej, bafilomycynę A1 i sacharozę jako środek lizosomotropowy. Zastosowano konfokalną laserową mikroskopię skaningową do oceny wielkości i kształtu polipleksów w warunkach hodowli komórkowej, wykrywania ich lokalizacji endolizosomalnej oraz obserwacji ich translokacji do jądra komórkowego.
- Wydajność transfekcji można zmienić, zmieniając MW i ilość polimeru dostępnego do tworzenia polipleksu. Największą wydajność transfekcji (około 44%), czyli frakcję komórek EGFP-dodatnich, uzyskano przy LPEI 5,6 kDa, natomiast cytotoksyczność pozostała niska. Zaobserwowano kolokalizację polipleksów i endolizosomów i okazało się, że większe polipleksy szczególnie szybko uciekały z kwaśnych organelli. Dla LPEI 5,0 i 9,0 kDa liczba komórek i jąder, które pobrały DNA po 6 godzinach, była podobna, jak określono metodą cytometrii przepływowej.
- Nasze badanie sugeruje, że LPEI o niskich MW są obiecującymi kandydatami do niewirusowego dostarczania genów, ponieważ są bardziej wydajne i znacznie mniej toksyczne niż ich odpowiedniki o wyższej MW .
Opłacalna transfekcja genów przez kompaktowanie DNA w pH 4,0 przy użyciu zakwaszonej polietylenoiminy o długim okresie trwałości .
- Wprowadzenie materiału genetycznego do komórek jest niezbędnym warunkiem aktualnych badań w biologii molekularnej komórki. Chociaż transfekcja dostępnymi w handlu odczynnikami skutkuje doskonałą ekspresją genów, ich wysokie koszty są przeszkodą w eksperymentowaniu z dużą liczbą lub dużą skalą transfekcji.
- Polimer kationowy liniowy – polietylenoimina ( MW 25 000) (PEI), jeden z najbardziej opłacalnych nośników, ułatwia kompaktowanie DNA poprzez tworzenie polipleksów, co prowadzi do wydajnego dostarczania DNA do komórek na drodze endocytozy. Jednak zastosowanie PEI jest nadal ograniczone z powodu znacznej cytotoksyczności i niedopuszczalnego pogorszenia wydajności transfekcji ze względu na jej niską stabilność. Tutaj pokazujemy, że zakwaszenie PEI jest ważne dla jej aktywności transfekcyjnej.
- Rozpuszczenie proszku PEI w 0,2N HCl zapewnia długi okres trwałości do przechowywania PEI w temperaturze 4 i -80 stopni C, a tworzenie polipleksu plazmidowego DNA z PEI jest zoptymalizowane w soli fizjologicznej buforowanej mleczanem przy pH 4,0.
- Ponadto zmiana pożywki hodowlanej 8-12 godzin po transfekcji może zminimalizować cytotoksyczność PEI bez poświęcania wysokiej wydajności transfekcji porównywalnej z wydajnością odczynników handlowych.
- Koszt testu z użyciem zakwaszonego PEI jest drastycznie obniżony do około 1:10 000 w porównaniu z odczynnikami komercyjnymi. Zatem wnioskujemy, że zakwaszenie PEI w sposób zadowalający zapewnia opłacalną, wysokowydajną transfekcję.
Test immunoenzymatyczny mikroprzepływowy z zastosowaniem mikroczipa krzemowego z unieruchomionymi przeciwciałami i detekcją chemiluminescencji.
- Mikrochipy krzemowe z unieruchomionymi przeciwciałami zostały wykorzystane do opracowania mikroprzepływowych testów immunologicznych enzymatycznych z zastosowaniem detekcji chemiluminescencji i peroksydazy chrzanowej (HRP) jako znacznika enzymu. Poliklonalne przeciwciała anty-atrazynowe sprzężono z powierzchnią mikroczipa krzemowego o całkowitym wymiarze 13,1 x 3,2 mm, zawierającą 42 porowate kanały przepływowe o głębokości 235 mikrometrów i szerokości 25 mikrometrów.
- Różne protokoły immobilizacji oparte na kowalencyjnej lub niekowalencyjnej modyfikacji powierzchni krzemionki 3-aminopropylotrietoksysilanem (APTES) lub 3-glicydoksypropylotrimetoksysilanem (GOPS), liniową polietylenoiminą (LPEI, masa cząsteczkowa 750 000) lub rozgałęzioną polietylenoiminą (BPEI, masa cząsteczkowa 25 000), a następnie adsorpcją lub kowalencyjne przyłączenie przeciwciała, oceniano w celu osiągnięcia najlepszej możliwości ponownego użycia, stabilności i czułości mikroprzepływowego testu immunoenzymatycznego (microFEIA).
- Adsorpcja przeciwciał na powierzchni krzemionki zmodyfikowanej LPEI i kowalencyjne przyłączenie do fizycznie zaadsorbowanego BPEI prowadzi do niestabilnych powłok przeciwciał. Kowalencyjne sprzężenie przeciwciał przez aldehyd glutarowy (GA) z trzema różnymi funkcjonalizowanymi powierzchniami krzemionki (APTES-GA, LPEI-GA i GOPS-BPEI-GA) dało powłoki przeciwciał, które można było całkowicie zregenerować przy użyciu 0,4 M glicyny/HCl, pH 2,2.
- Wykazano, że kompozycja buforowa ma dramatyczny wpływ na stabilność testu, gdzie powszechnie stosowana sól fizjologiczna buforowana fosforanami okazała się najmniej odpowiednim wyborem.
- Najlepszą długoterminową stabilność uzyskano dla powierzchni LPEI-GA bez utraty aktywności przeciwciał w ciągu jednego miesiąca. Granice wykrywalności w microFEIA dla trzech różnych powierzchni immunologicznych wynosiły 45, 3,8 i 0,80 ng/l (209, 17,7 i 3,7 pM) odpowiednio dla APTES-GA, LPEI-GA i GOPS-BPEI-GA.
Dostarczanie genów oparte na folianie-PEG-folianie-przeszczepie- polietylenoiminie .
- Folian-glikol polietylenowy-folian szczepiony polietylenoiminą (FPF-g-PEI) zsyntetyzowano przez połączenie kwasu foliowego z obydwoma końcami jednofunkcyjnego PEG, a następnie szczepienie na PEI. Stosunek szczepienia określono stosując prawo Beera, mierząc absorbancję UV przy 363 nm.
- Określono profil pH, średnicę i kształt nośników. Wydajność transfekcji została zoptymalizowana w normalnych komórkach mięśni gładkich (SMC) i komórkach gruczolakoraka okrężnicy CT-26 przy użyciu plazmidowego DNA kodującego gen reporterowy lucyferazy. Wykazano, że wolny kwas foliowy hamuje transfekcję z FPF-2,3 g-PEI przy obojętnym stosunku ładunku.
- Toksyczność względną pomiędzy PEI a zmodyfikowanym nośnikiem mierzono za pomocą testu kolorymetrycznego MTT. Potencjał terapeutyczny pmIFN-gamma skompleksowanego z tymi nośnikami polimerowymi pod względem ekspresji genów określono na poziomie białka i mRNA za pomocą ELISA i RT-PCR. Stwierdzono, że FPF-g-PEI ma liniowe polimery 2,3 folan-PEG-folian (FPF) wszczepione do każdej cząsteczki PEI.
- Zmierzona średnia masa cząsteczkowa wynosiła około 33500 Mw , a profil pH był charakterystyczny dla zdolności do rozrywania endosomów. Mikroskopia sił atomowych (AFM) i dynamiczne rozpraszanie światła laserowego (DLLS) wykazały, że FPF-2,3 g-PEI i PEI (w stosunku wagowym 2) skutecznie skondensowany plazmid
- DNA dające polipleksy sferoidalne o średniej średnicy około 150 nm. FPF-2,3 g-PEI przewyższał PEI pod względem cytotoksyczności i wydajności transfekcji w komórkach nowotworowych. Komórki mięśni gładkich nie wykazywały swoistości wobec kompleksów kwasu foliowego na uwięzi, gdzie kompleksy PEI/pLuc dawały wyższą wydajność.
Preparaty na bazie polietylenoiminy do dostarczania oligonukleotydów.
- Polietylenoimina (PEI) jest dobrze znana jako niewirusowy wektor do dostarczania genów, zwłaszcza do dostarczania oligonukleotydów. Jednak jego zastosowania kliniczne są znacznie ograniczone ze względu na wysoki ładunek kationowy, niskie rozpoznawanie komórek oraz oddziaływanie z białkami i komórkami niedocelowymi w płynach biologicznych, co skutkuje wysoką cytotoksycznością, słabą stabilnością i niską wydajnością transfekcji w transporcie oligonukleotydów.
- Wielu badaczy stwierdziło, że masa cząsteczkowa ( MW ) PEI, stopień rozgałęzionej lub liniowej struktury, stosunek N/P, pojemność buforowa, struktura oligonukleotydów, pH pożywki hodowlanej, surowica i różne typy cząstek opartych na PEI, w tym metody przygotowania, powodują duża różnica w toksyczności komórkowej, stabilności, wydajności transfekcji dla systemów dostarczania oligonukleotydów opartych na PEI.
- Ligandy, małe cząsteczki, peptydy ukierunkowane na sprzęganie, hydrofobowe, hydrofilowe i amfifilowe modyfikacje PEI są również dokładnie badane w celu zmniejszenia toksyczności komórkowej i poprawy stabilności, wydajności transfekcji i efektu terapeutycznego.
- Co więcej, różne inteligentne modyfikacje PEI, takie jak wiązanie reagujące na pH (wiązanie hydrazonowe) i wiązanie wrażliwe na reakcję redoks (wiązanie disiarczkowe) mogą dokładnie kontrolować uwalnianie oligonukleotydów i przyciągnęły uwagę w zakresie wydajnego dostarczania oligonukleotydów.
Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 10,000) |
|||
PEG-10K | Alpha Diagnostics | 100 mg | 270 EUR |
Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 5,000) |
|||
PEG-5K | Alpha Diagnostics | 100 mg | 270 EUR |
Methoxy PEG Maleimide linear (MW: 20,000) |
|||
PEGM-20K | Alpha Diagnostics | 100 mg | 270 EUR |
Methoxy PEG Carboxy Acetic Acid (MW: 5000-linear) |
|||
PEG-05K-COH | Alpha Diagnostics | 100 mg | 196.8 EUR |
Chlorotoxin(linear) |
|||
HY-P0173 | MedChemExpress | 25mg | 2292 EUR |
Polyethylenimine, 50 % w/v, 100 ML |
|||
M-CSS-257 | MiTeGen | 4 x 25 ml | 108 EUR |
Anantin (linear sequence) |
|||
5-00672 | CHI Scientific | 4 x 1mg | Ask for price |
Anantin (linear sequence) |
|||
H-8140.0001 | Bachem | 1.0mg | 691.2 EUR |
Anantin (linear sequence) |
|||
H-8140.0005 | Bachem | 5.0mg | 2648.4 EUR |
Sartorius Linear Stand |
|||
PIP7678 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 84.36 EUR |
AXYPREP MAG DYECLEAN KIT- 250 ML - 25000 PREPS. |
|||
MAG-DYECL-250 | CORNING | 1/pk | 5018.4 EUR |
Linear Polyacrylamide (5mg/ml) |
|||
S143 | GeneOn | 1 ml | 48 EUR |
Linear Kinetoplast DNA Marker |
|||
TG2018-1 | TopoGen | 10 ug | 214.8 EUR |
Linear pRYG DNA Marker |
|||
TG2028-1 | TopoGen | 10 ug | 214.8 EUR |
Rainbow Linear Calibration Particles |
|||
RLP-30-5 | Spherotech | 5 mL | 376.8 EUR |
Linear Platform For BAT1100 |
|||
BAT1102 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 479.94 EUR |
IKA Shaker HS501D Linear |
|||
SHA2072 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 6135.48 EUR |
Rat Monoclonal Anti-Dinitrophenyl (DNP) IgG1, aff pure (w/o azide) |
|||
DNP15-MW | Alpha Diagnostics | 100 ug | 534 EUR |
Magnetic Wand with rubber grips for SPINE caps |
|||
MW-1C | MiTeGen | 1 WAND | 155 EUR |
UNIVERSAL LINEAR 4 PLACE STAND |
|||
AP-USD4 | CORNING | 1/pk | 84 EUR |
Human recombinant linear di-ubiquitin |
|||
6424-100 | Biovision | each | 346.8 EUR |
Human recombinant linear tri-ubiquitin |
|||
6425-100 | Biovision | each | 346.8 EUR |
Human recombinant linear tetra-ubiquitin |
|||
6426-100 | Biovision | each | 346.8 EUR |
Human recombinant linear penta-ubiquitin |
|||
6427-100 | Biovision | each | 346.8 EUR |
UNIVERSAL LINEAR RACK FOR SIX PIPETTES |
|||
4079 | CORNING | 1/pk | 84 EUR |
Linear Poly Acrylamide Solution (5mg/ml) |
|||
LK548 | Bio Basic | 1ml | 75.66 EUR |
mPEG-BSA (Molecular Weight: 5,000-linear) |
|||
PEG-BSA-05K | Alpha Diagnostics | 100 ug | 343.2 EUR |
mPEG-BSA (Molecular Weight: 10,000-linear) |
|||
PEG-BSA-10K | Alpha Diagnostics | 100 ug | 343.2 EUR |
mPEG-BSA (Molecular Weight: 20,000-linear) |
|||
PEG-BSA-20K | Alpha Diagnostics | 100 ug | 343.2 EUR |
mPEG-BSA (Molecular Weight: 40,000-linear) |
|||
PEG-BSA-40K | Alpha Diagnostics | 100 ug | 343.2 EUR |
Nicotinic Acid Linear Set w/ Blank in Cuvs |
|||
RSPEC1027 | Scientific Laboratory Supplies | PK5 | 2981.1 EUR |
MW-150 |
|||
HY-120111 | MedChemExpress | 10mM/1mL | 590.4 EUR |
2K Plus DNA Marker (8 linear double-stranded DNA bands) |
|||
20-abx098046 | Abbexa |
|
|
2K Plus DNA Marker (9 linear double-stranded DNA bands) |
|||
20-abx098047 | Abbexa |
|
|
100bp Plus DNA Marker (12 linear double-stranded DNA bands) |
|||
20-abx098053 | Abbexa |
|
|
100bp Plus DNA Marker (14 linear double-stranded DNA bands) |
|||
20-abx098054 | Abbexa |
|
|
Spectropho Pot Dichro Linear Std Set w/ Blank in Cuvs |
|||
RSPEC1022 | Scientific Laboratory Supplies | PK6 | 3499.8 EUR |
Allopurinol |
|||
A8360-25000 | ApexBio | 25 g | 181.2 EUR |
Methimazole |
|||
A8472-25000 | ApexBio | 25 g | 282 EUR |
Sodium Orthovanadate |
|||
A8524-25000 | ApexBio | 25 g | 268.8 EUR |
HATU |
|||
A7022-25000 | ApexBio | 25 g | 169.2 EUR |
HOAt |
|||
A7024-25000 | ApexBio | 25 g | 166.8 EUR |
HOOBt |
|||
A7026-25000 | ApexBio | 25 g | 127.2 EUR |
HCTU |
|||
A7027-25000 | ApexBio | 25 g | 174 EUR |
PyBOP |
|||
A7029-25000 | ApexBio | 25 g | 115.2 EUR |
HMP Linker |
|||
A7041-25000 | ApexBio | 25 g | 186 EUR |
Rink Amide Linker |
|||
A7042-25000 | ApexBio | 25 g | 265.2 EUR |
Ramage Linker,Fmoc-Suberol |
|||
A7043-25000 | ApexBio | 25 g | 282 EUR |
DMAP |
|||
A7055-25000 | ApexBio | 25 g | 135.6 EUR |
5-Ethyltio-1H-Tetrazole |
|||
A7058-25000 | ApexBio | 25 g | 160.8 EUR |
Tetrazole |
|||
A7061-25000 | ApexBio | 25 g | 110.4 EUR |
H-D-Ala-OBzl.TosOH |
|||
A7070-25000 | ApexBio | 25 g | 278.4 EUR |
L-NAME hydrochloride |
|||
A7088-25000 | ApexBio | 25 g | 268.8 EUR |
H-Cys(Trt)-OH |
|||
A7143-25000 | ApexBio | 25 g | 126 EUR |
Bz-Glu-OH |
|||
A7158-25000 | ApexBio | 25 g | 146.4 EUR |
H-Glu(OEt)-OEt.HCl |
|||
A7170-25000 | ApexBio | 25 g | 132 EUR |
H-Glu(OtBu)-OtBu.HCl |
|||
A7175-25000 | ApexBio | 25 g | 271.2 EUR |
H-Lys(Ac)-OH.HCl |
|||
A7231-25000 | ApexBio | 25 g | 274.8 EUR |
H-Lys(Boc)-OH |
|||
A7232-25000 | ApexBio | 25 g | 249.6 EUR |
H-Lys(Z)-OH |
|||
A7237-25000 | ApexBio | 25 g | 94.8 EUR |
H-Pro-OtBu |
|||
A7281-25000 | ApexBio | 25 g | 278.4 EUR |
H-Ser-OBzl.HCl |
|||
A7294-25000 | ApexBio | 25 g | 284.4 EUR |
H-Ser(Bzl)-OH |
|||
A7295-25000 | ApexBio | 25 g | 196.8 EUR |
Fmoc-Ala-OMe |
|||
A7301-25000 | ApexBio | 25 g | 1062 EUR |
Fmoc-Arg-OH |
|||
A7306-25000 | ApexBio | 25 g | 169.2 EUR |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH |
|||
A7308-25000 | ApexBio | 25 g | 199.2 EUR |
Boc-Asp-OtBu |
|||
A7349-25000 | ApexBio | 25 g | 393.6 EUR |
Fmoc-Arg(Tos)-OH |
|||
A7352-25000 | ApexBio | 25 g | 243.6 EUR |
Fmoc-Asn(Trt)-OH |
|||
A7357-25000 | ApexBio | 25 g | 111.6 EUR |
Fmoc-Asp-OH |
|||
A7361-25000 | ApexBio | 25 g | 174 EUR |
Fmoc-Asp-OAll |
|||
A7362-25000 | ApexBio | 25 g | 904.8 EUR |
Fmoc-Asp-OtBu |
|||
A7364-25000 | ApexBio | 25 g | 505.2 EUR |
H-Ser(tBu)-OBzl.HCl |
|||
A7380-25000 | ApexBio | 25 g | 303.6 EUR |
H-Val-OtBu.HCl |
|||
A7441-25000 | ApexBio | 25 g | 236.4 EUR |
Fmoc-Cha-OH |
|||
A7460-25000 | ApexBio | 25 g | 622.8 EUR |
Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH |
|||
A7482-25000 | ApexBio | 25 g | 578.4 EUR |
H-Cit-OH |
|||
A7486-25000 | ApexBio | 25 g | 110.4 EUR |
H-D-Dab-OH.2HCl |
|||
A7493-25000 | ApexBio | 25 g | 969.6 EUR |
Boc-N-Me-Ala-OH |
|||
A7522-25000 | ApexBio | 25 g | 358.8 EUR |
Fmoc-N-Me-Asp(OtBu)-OH |
|||
A7526-25000 | ApexBio | 25 g | 5613.6 EUR |
Fmoc-N-Me-Ile-OH |
|||
A7528-25000 | ApexBio | 25 g | 578.4 EUR |
H-D-N-Me-Leu-OBzl.TosOH |
|||
A7530-25000 | ApexBio | 25 g | 3400.8 EUR |
H-Phe(4-F)-OH |
|||
A7531-25000 | ApexBio | 25 g | 505.2 EUR |
H-D-Phe(2-F)-OH.HCl |
|||
A7539-25000 | ApexBio | 25 g | 908.4 EUR |
H-HoArg-OH |
|||
A7543-25000 | ApexBio | 25 g | 358.8 EUR |
Boc-HoArg(NO2)-OH |
|||
A7544-25000 | ApexBio | 25 g | 2131.2 EUR |
H-HoSer-OH |
|||
A7583-25000 | ApexBio | 25 g | 292.8 EUR |
Fmoc-Hyp-OH |
|||
A7599-25000 | ApexBio | 25 g | 201.6 EUR |
H-DL-Nva-OH |
|||
A7656-25000 | ApexBio | 25 g | 122.4 EUR |
m-NH2-Tyr-OH.2HCl |
|||
A7700-25000 | ApexBio | 25 g | 466.8 EUR |
Z-N-Me-Ala-OH |
|||
A7704-25000 | ApexBio | 25 g | 842.4 EUR |
Fmoc-N-Me-Leu-OH |
|||
A7705-25000 | ApexBio | 25 g | 549.6 EUR |
Fmoc-D-N-Me-Leu-OH |
|||
A7706-25000 | ApexBio | 25 g | 727.2 EUR |
Boc-D-N-Me-Phe.DCHA |
|||
A7707-25000 | ApexBio | 25 g | 795.6 EUR |
Boc-N-Me-Phe.DCHA |
|||
A7708-25000 | ApexBio | 25 g | 243.6 EUR |
Z-N-Me-Phe-OH |
|||
A7709-25000 | ApexBio | 25 g | 1125.6 EUR |
Boc-N-Me-Phg-OH |
|||
A7710-25000 | ApexBio | 25 g | 854.4 EUR |
Boc-D-N-Me-Phg-OH |
|||
A7711-25000 | ApexBio | 25 g | 375.6 EUR |
H-N-Me-Pro-OH |
|||
A7712-25000 | ApexBio | 25 g | 1615.2 EUR |
Boc-N-Me-Ser(tBu)-OH |
|||
A7714-25000 | ApexBio | 25 g | 1194 EUR |
Ogólnie rzecz biorąc, wydajne dostarczanie oligonukleotydów można osiągnąć dzięki różnym modyfikacjom PEI ze zoptymalizowanymi parametrami preparatów opartych na PEI lub PEI.