- W niniejszej pracy przedstawiono schemat izolacji wielu składników ludzkiego dopełniacza w stanie funkcjonalnym i biochemicznie czystym oraz z pełną aktywnością hemolityczną. Te procedury preparatywne pozwalają na odzyskanie dużych ilości miligramowych i gramowych poszczególnych składników dopełniacza z dużej puli (2-11 litrów) świeżego osocza EDTA w nie więcej niż czterech etapach chromatograficznych.
- Wiele składników (C3bINA, C5, C3, C1EI, C4 i C9) odzyskuje się funkcjonalnie czystych lub wysoce oczyszczonych po pierwszym etapie chromatograficznym z zastosowaniem DEAE-Sephacel i można je wykorzystać jako odczynniki bez dalszego oczyszczania. Przed wymianą anionową poszczególne jednostki osocza traktuje się inhibitorami aktywacji dopełniacza i proteazami surowicy, połączone osocze frakcjonuje się glikolem polietylenowym, zubożonym w plazminogen na S
- Sepharose-lizyna i szybko ultrafiltrowana do niskiej siły jonowej i wysokiego stężenia białka . Wysoki stopień rozdzielenia składników na DEAE-Sephacel uzyskany później jest wykazany przez funkcjonalne odzyskiwanie i oczyszczanie w reprezentatywnym eksperymencie, jak wskazano (w kolejności ich elucji) dla następujących białek : C3bINA (24%, 18-krotne), C2 (74%, 12-krotnie), C7 (87%, 14-krotnie), czynnik B (55%, 8,7-krotnie), C8 (50%, 16-krotnie), C6 (82%, 25-krotnie ), beta 1H (39%, 12-krotnie), C5 (62%, 111-krotnie), C3 (99%, 64-krotnie), C1EI (42%, 135-krotnie), C9 (80%, 297- krotnie) i c4 (78%, 164-krotnie). Inne składniki oddzielone tymi procedurami obejmują białko wiążące C1q i C4 .
- Opisane dodatkowe etapy, które demonstrują użyteczność i skuteczność tego schematu preparatywnego, umożliwiły wyizolowanie C3, C5 i C7 jako czystych składników o pełnej aktywności hemolitycznej, ocenianej na podstawie kryteriów funkcjonalnych, immunochemicznych i fizykochemicznych. C8, również wyizolowany jako jednorodne białko , odzyskano z częściową aktywnością hemolityczną.
- Wszystkie te składniki odzyskano z wysoką wydajnością i podczas oczyszczania, jak wskazano: C3 (61%, 103-krotne), C5 (24%, 1350-krotne), C7 (19%, 2260-krotne) i C8 (32%, 547-krotnie). Składniki dopełniacza C6, beta 1H, czynnik B i C2 oprócz C3bINA, C1EI, C4 i C9 są odzyskiwane częściowo oczyszczone z dobrą aktywnością i nadają się do dalszego oczyszczania.
Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II syntetyzują i wydzielają białka klasycznych i alternatywnych szlaków dopełniacza .
- Układ dopełniacza surowicy jest głównym mediatorem reakcji zapalnych. Dwa z białek dopełniacza , trzeci (C3) i piąty (C5) składnik, są prekursorami silnych cząsteczek flogistycznych, C3a i C5a. C5a ma silne działanie chemotaktyczne i odgrywa aktywną rolę w zapaleniu płuc.
- Przedstawiamy dowody sugerujące, że kilka białek dopełniacza , w tym C5, jest syntetyzowanych lokalnie w płucach w komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych typu II. Tkanka płucna normalnych myszy syntetyzowała i wydzielała białko C5 podobne do białka C5 w mysiej surowicy, podczas gdy tkanka płucna myszy z niedoborem C5 nie.
- Tkanki płuc z myszy normalnych iz niedoborem C5 zsyntetyzowały C3. Tkanka płuc szczura syntetyzowała i wydzielała C5, a także C2, C4 , C3 i czynnik B. Hodowle komórek typu II (95% komórek typu II, 5% makrofagów) regularnie syntetyzowały wszystkie te białka . W przeciwieństwie do tego, same kultury makrofagów zsyntetyzowały duże ilości C2 i czynnika B, aw niektórych eksperymentach C3 i C4 , ale nigdy C5. C5 syntetyzowany przez komórki szczura był nieco większy niż C5 w surowicy (200 kD w porównaniu z 180 kD) i nie został przetworzony do dwułańcuchowej cząsteczki obserwowanej w surowicy.
- Tkanka płuca szczura i oczyszczone komórki typu II zawierały mRNA C5 o tej samej masie cząsteczkowej co mRNA C5 w wątrobie szczura oraz w płucach i wątrobie myszy. Komórki człowieka typu II syntetyzowały również C5, a także C2, C4 , C3 i czynnik B.
- Ludzkie makrofagi płucne syntetyzowały tylko C2, czynnik B i, w niektórych eksperymentach, C3. Synteza białek dopełniacza w komórkach wyściełających ścianę pęcherzyka może stanowić lokalne źródło tych białek dla odpowiedzi zapalnych w płucach. Lokalną syntezę białek dopełniacza można regulować niezależnie od syntezy w wątrobie.
Inaktywator ludzkiego dopełniacza C3b: izolacja, charakterystyka i wykazanie bezwzględnego zapotrzebowania na białko surowicy beta1H do rozszczepienia C3b i C4b w roztworze.
- Enzym regulatorowy dopełniacza , inaktywator C3b (C3bINA), został oczyszczony z ludzkiej surowicy przez chromatografię powinowactwa na kolumnie anty-C3bINA Sepharose. Późniejsza chromatografia na DEAE-celulozie i usunięcie IgG za pomocą anty-IgG Sepharose dała produkt, który okazał się jednorodny za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym przy pH 8,9 i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu.
- Cząsteczka składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych związanych mostkami dwusiarczkowymi o masie cząsteczkowej 50 000 i 38 000 daltonów. Stwierdzono, że ludzka CobINA jest glikoproteiną zawierającą co najmniej 10,7% węglowodanów i ma normalne stężenie w surowicy 34 +/- 7 ug/ml (średnia +/- 1 SD). Wysoce oczyszczone C3bINA nie trawiły ani wolnego C3b, ani wolnego C4b, jeśli śladowe ilości zanieczyszczającego beta1H usunięto z tych białek za pomocą anty-beta1H Sepharose.
- Jednak w obecności wysoce oczyszczonego beta1H i C3bINA, zarówno C3bIna, jak i C3b i C4b zostały rozszczepione. Inkubacja natywnego C3 lub C4 z C3bINA i beta1H nie miała wpływu na ich rozszczepienie. Inkubacja natywnego C3 lub C4 z C3bINA i beta1H nie miała wpływu na ich strukturę. Działanie C3bINA i beta1H na C3b dało dwa fragmenty łańcucha alfa1, które nie dysocjowały bez redukcji cząsteczki.
- Te fragmenty mają masę cząsteczkową 67 000 i 40 000 daltonów. Działanie C3bINA i beta1H na C4b spowodowało rozszczepienie łańcucha alfa’ dając początek fragmentom C4c o długości 150 000 daltonów i C4d o długości 49 000 daltonów , które dysocjowały bez redukcji. Wydaje się, że do wytworzenia z C3b immunochemicznie zdefiniowanych fragmentów C3c i C3d wymagane jest działanie dodatkowego enzymu surowicy, którego działanie może naśladować trypsyna.
Wzmocnienie fagocytozy bakteryjnej przez surowicę. Rola składników dopełniacza i dwóch kofaktorów.
- Rolę czynników surowiczych w fagocytozie pneumokoków badano za pomocą testu spektrofotometrycznego, który mierzy zredukowany barwnik nitro-błękit tetrazolowy (NBT). Redukcja barwnika występuje w fagocytach wkrótce po spożyciu bakterii, mierzona techniką indeksu fagocytarnego i wychwytem (125)I-pneumokoków. Bakterie przygotowane z przeciwciałem gammaG nie były fagocytowane, chyba że dodano małą objętość świeżej normalnej surowicy. Używając świeżych surowic z niedoborem pojedynczych składników dopełniacza , wykazano, że pierwsze cztery składniki są niezbędne do optymalnej fagocytozy bakteryjnej.
- Gdy wysoce oczyszczone składniki dopełniacza zostały dodane do pneumokoków pokrytych przeciwciałem, wzmocnienie fagocytozy osiągnięto tylko przez kolejne dodanie C1, C4 , C2 i C3. Przedstawiono dowody, że ludzki C3 związany z kompleksem immunologicznym wykazuje aktywność peptydazy i że ta aktywność jest niezbędna dla fagocytozy.
- Termolabilny, dializowalny kofaktor surowicy, który wzmaga aktywność peptydazy C3, wzmaga fagocytozę pneumokoków przygotowanych z oczyszczonymi składnikami dopełniacza .
Human Complement 4 (C4) Purified protein |
|||
| HC411-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Human Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| DLR-C4-Hu-48T | DL Develop | 48T | 574.8 EUR |
Human Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| DLR-C4-Hu-96T | DL Develop | 96T | 745.2 EUR |
Human Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| RDR-C4-Hu-48Tests | Reddot Biotech | 48 Tests | 600 EUR |
Human Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| RDR-C4-Hu-96Tests | Reddot Biotech | 96 Tests | 830.4 EUR |
Human Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| RD-C4-Hu-48Tests | Reddot Biotech | 48 Tests | 573.6 EUR |
Human Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| RD-C4-Hu-96Tests | Reddot Biotech | 96 Tests | 794.4 EUR |
Mouse Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| DLR-C4-Mu-48T | DL Develop | 48T | 586.8 EUR |
Mouse Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| DLR-C4-Mu-96T | DL Develop | 96T | 762 EUR |
Rat Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| DLR-C4-Ra-48T | DL Develop | 48T | 609.6 EUR |
Rat Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| DLR-C4-Ra-96T | DL Develop | 96T | 793.2 EUR |
Mouse Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| RDR-C4-Mu-48Tests | Reddot Biotech | 48 Tests | 613.2 EUR |
Mouse Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| RDR-C4-Mu-96Tests | Reddot Biotech | 96 Tests | 850.8 EUR |
Mouse Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| RD-C4-Mu-48Tests | Reddot Biotech | 48 Tests | 586.8 EUR |
Mouse Complement Component 4 (C4) ELISA Kit |
|||
| RD-C4-Mu-96Tests | Reddot Biotech | 96 Tests | 812.4 EUR |
Human Complement C4 Protein |
|||
| 20-abx060108 | Abbexa |
|
|
Human Complement C4 Protein |
|||
| abx060232-1mg | Abbexa | 1 mg | 678 EUR |
Complement C4 protein |
|||
| 30-1087 | Fitzgerald | 1 mg | 631.2 EUR |
Complement C4 protein |
|||
| 32R-AC050 | Fitzgerald | 1 mg | 688.8 EUR |
Complement C4 protein |
|||
| 32R-AC050-10 | Fitzgerald | 10 mg | 3561.6 EUR |
Human Complement C4 Antibody |
|||
| 41231-05011 | AssayPro | 150 ug | 260.4 EUR |
Human Complement C4 Antibody |
|||
| 11231-05011 | AssayPro | 150 ug | 260.4 EUR |
Complement C4 antibody |
|||
| 20-S0611G000-S4 | Fitzgerald | 10 ml | 139.2 EUR |
Complement C4 antibody |
|||
| 20C-CR2019G | Fitzgerald | 1 ml | 198 EUR |
Complement C4 antibody |
|||
| 20C-CR2019SP | Fitzgerald | 1 ml | 188.4 EUR |
Complement C4 antibody |
|||
| 20C-CR6023SP | Fitzgerald | 1 ml | 298.8 EUR |
Complement C4 antibody |
|||
| 10R-2962 | Fitzgerald | 100 ug | 318 EUR |
Complement C4 Antibody |
|||
| abx023306-10ml | Abbexa | 10 ml | 493.2 EUR |
Complement C4 Antibody |
|||
| abx023307-10ml | Abbexa | 10 ml | 360 EUR |
Complement C4 Antibody |
|||
| abx024154-10ml | Abbexa | 10 ml | 895.2 EUR |
Bovine C4/ Complement C4 ELISA Kit |
|||
| E0044Bo | Sunlong | 1 Kit | 860.4 EUR |
Rat C4/ Complement C4 ELISA Kit |
|||
| E1056Ra | Sunlong | 1 Kit | 685.2 EUR |
Human Complement C1 purified protein |
|||
| HC115-R-50 | Alpha Diagnostics | 50 ug | 416.4 EUR |
Human Complement C1q purified protein |
|||
| HC1Q15-R-250 | Alpha Diagnostics | 250 ug | 343.2 EUR |
Human Complement Component 4 (C4) Protein |
|||
| 20-abx166498 | Abbexa |
|
|
Human Complement C4-B (C4B) |
|||
| 1-CSB-YP313364HU | Cusabio |
|
|
Human Complement C5 purified |
|||
| C551N-50 | Alpha Diagnostics | 50 ug | 343.2 EUR |
Human Complement C5a purified |
|||
| C56A15N-10 | Alpha Diagnostics | 10 ug | 489.6 EUR |
Complement C4 Assay Kit |
|||
| abx098418-BeckmanR160ml1R215ml1 | Abbexa | Beckman; R1: 60ml×1 R2: 15ml×1 | 322.8 EUR |
Complement C4 Assay Kit |
|||
| abx098418-Hitachi7020R140ml1R210ml1 | Abbexa | Hitachi 7020; R1: 40ml×1 R2: 10ml×1 | 284.4 EUR |
Complement C4 Assay Kit |
|||
| abx098418-Hitachi7060R140ml1R210ml1 | Abbexa | Hitachi 7060; R1: 40ml×1 R2: 10ml×1 | 284.4 EUR |
Complement C4 Assay Kit |
|||
| abx098418-Hitachi7170R132ml1R28ml1 | Abbexa | Hitachi 7170; R1: 32ml×1 R2: 8ml×1 | 284.4 EUR |
Complement 4 (C4) Antibody |
|||
| abx024153-50ml | Abbexa | 50 ml | 910.8 EUR |
Human Complement C4-Binding Protein (C4BP) Antibody |
|||
| 11274-05011 | AssayPro | 150 ug | 260.4 EUR |
Human Complement 2 (C2) purified protein |
|||
| HC215-R-50 | Alpha Diagnostics | 50 ug | 548.4 EUR |
Human Complement 3 (C3) purified protein |
|||
| HC315-R-250 | Alpha Diagnostics | 250 ug | 708 EUR |
Human Complement 3a (C3a) purified protein |
|||
| HC3A15-R-25 | Alpha Diagnostics | 25 ug | 416.4 EUR |
Human Complement 3b (C3b) purified protein |
|||
| HC3B15-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Human Complement 3c (C3c) purified protein |
|||
| HC3C15-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Human Complement 6 (C6) Purified Protein |
|||
| HC615-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Human Complement 7 (C7) Purified Protein |
|||
| HC715-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Human Complement 8 (C8) Purified Protein |
|||
| HC815-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Human Complement 9 (C9) Purified Protein |
|||
| HC915-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Mouse Complement Component 4 (C4) Protein |
|||
| 20-abx168671 | Abbexa |
|
|
Chicken Complement Component 4 (C4) Protein |
|||
| 20-abx166368 | Abbexa |
|
|
Mouse Complement Component 4 (C4) Protein |
|||
| 20-abx167319 | Abbexa |
|
|
Human Complement 4, C4 ELISA Kit |
|||
| CSB-E08705h-24T | Cusabio | 1 plate of 24 wells | 198 EUR |
Human Complement 4, C4 ELISA Kit |
|||
| 1-CSB-E08705h | Cusabio |
|
|
Human Complement 4,C4 ELISA Kit |
|||
| CN-03808H1 | ChemNorm | 96T | 556.8 EUR |
Human Complement 4,C4 ELISA Kit |
|||
| CN-03808H2 | ChemNorm | 48T | 375.6 EUR |
Human Complement 4(C4)ELISA Kit |
|||
| GA-E0343HM-48T | GenAsia Biotech | 48T | 346.8 EUR |
Human Complement 4(C4)ELISA Kit |
|||
| GA-E0343HM-96T | GenAsia Biotech | 96T | 559.2 EUR |
Human Complement C4 Antibody (Biotin Conjugate) |
|||
| 41231-05021 | AssayPro | 150 ug | 331.2 EUR |
Human Complement C4 Antibody (Biotin Conjugate) |
|||
| 11231-05021 | AssayPro | 150 ug | 331.2 EUR |
Human Complement 4,C4 ELISA Kit |
|||
| 201-12-0327 | SunredBio | 96 tests | 528 EUR |
Human Complement C4 AssayMax ELISA Kit |
|||
| EC2102-1 | AssayPro | 96 Well Plate | 500.4 EUR |
Human Complement C4 AssayMax ELISA Kit |
|||
| EC3202-1 | AssayPro | 96 Well Plate | 475.2 EUR |
Human Complement 4(C4)ELISA Kit |
|||
| QY-E04092 | Qayee Biotechnology | 96T | 433.2 EUR |
Human Complement 4,C4 ELISA Kit |
|||
| YLA1146HU-48T | Shanghai YL Biotech | 48T | 435 EUR |
Human Complement 4,C4 ELISA Kit |
|||
| YLA1146HU-96T | Shanghai YL Biotech | 96T | 562.5 EUR |
C4 ELISA Kit| Monkey Complement C4 ELISA Kit |
|||
| EF012770 | Lifescience Market | 96 Tests | 826.8 EUR |
Human Complement C5b,6, purified |
|||
| C57A15N-10 | Alpha Diagnostics | 10 ug | 489.6 EUR |
Human Complement C5a desArg, purified |
|||
| C57A16N-10 | Alpha Diagnostics | 10 ug | 489.6 EUR |
Complement C4-B Polyclonal Antibody |
|||
| 42628-100ul | SAB | 100ul | 399.6 EUR |
Complement C4 antibody (beta-chain) |
|||
| 10R-8470 | Fitzgerald | 100 ul | 471.6 EUR |
Complement C4 antibody (gamma-chain) |
|||
| 10R-8471 | Fitzgerald | 100 ul | 471.6 EUR |
Complement C4 beta chain antibody |
|||
| 10R-8481 | Fitzgerald | 100 ul | 471.6 EUR |
Complement C4-B (C4B) Antibody |
|||
| 20-abx109270 | Abbexa |
|
|
Complement Component 4 (C4) Antibody |
|||
| 20-abx104771 | Abbexa |
|
|
Complement C4-B (C4B) Antibody |
|||
| 20-abx171870 | Abbexa |
|
|
Complement Component 4 (C4) Antibody |
|||
| 20-abx171884 | Abbexa |
|
|
Complement Component 4 (C4) Antibody |
|||
| 20-abx171885 | Abbexa |
|
|
Complement C4-B (C4B) Antibody |
|||
| 20-abx175970 | Abbexa |
|
|
Complement Component 4 (C4) Antibody |
|||
| 20-abx175977 | Abbexa |
|
|
Complement Component 4 (C4) Antibody |
|||
| 20-abx130746 | Abbexa |
|
|
Complement Component 4 (C4) Antibody |
|||
| 20-abx128547 | Abbexa |
|
|
Complement Component 4 (C4) Antibody |
|||
| 20-abx129540 | Abbexa |
|
|
Complement C4 beta chain Antibody |
|||
| abx019061-100ug | Abbexa | 100 ug | 410.4 EUR |
Complement Component 4 (C4) Antibody |
|||
| 20-abx270265 | Abbexa |
|
|
Recombinant Complement C4-B (C4B) |
|||
| 4-RPB305Hu03 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Complement Component 4 (C4) |
|||
| 4-RPA888Ga01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Complement Component 4 (C4) |
|||
| 4-RPA888Hu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Complement Component 4 (C4) |
|||
| 4-RPA888Mu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Complement Component 4 (C4) |
|||
| 4-RPA888Mu02 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Complement Component 4 (C4) |
|||
| 4-RPA888Ra01 | Cloud-Clone |
|
|
Human Complement Factor B (CFB) Purified Protein |
|||
| HCFB15-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Human Complement Factor D (CFD) Purified Protein |
|||
| HCFD15-R-10 | Alpha Diagnostics | 10 ug | 416.4 EUR |
Human Complement Factor H (CFH) Purified Protein |
|||
| HCFH15-R-100 | Alpha Diagnostics | 100 ug | 416.4 EUR |
Human Complement Factor I (CFI) Purified Protein |
|||
| HCFI15-R-25 | Alpha Diagnostics | 25 ug | 416.4 EUR |
Human Complement Factor P (CFP) Purified Protein |
|||
| HCFP15-R-25 | Alpha Diagnostics | 25 ug | 416.4 EUR |
Stwierdzono, że drugim kofaktorem promującym fagocytozę, który nie jest składnikiem dopełniacza , jest nietrwała termicznie pseudoglobulina 5-6S-beta. Białko to może stabilizować aktywność peptydazy C3 lub hamować enzymatyczną inaktywację C3.
