- Selektywny antagonizm transportu serotoniny (<em>5</em>-hydroksytryptaminy, <em>5</em>HT) i noradrenaliny przez leki przeciwdepresyjne jest kluczowym elementem hipotezy „aminy” dotyczącej zaburzeń afektywnych. Doniesiono, że miejsca wychwytu i/lub transportu <em>5</em>HT są zmniejszone w płytkach krwi pacjentów cierpiących na depresję oraz w pobranych pośmiertnie próbkach mózgów pacjentów z depresją i ofiar samobójstw.
- Do tej pory dostępnych było niewiele informacji molekularnych na temat struktury i regulacji <em>5</em>HT <em>transporterów</em>. Stosując reakcję łańcuchową polimerazy ze zdegenerowanymi oligonukleotydami pochodzącymi z dwóch wysoce konserwatywnych regionów <em>transporterów</em> noradrenaliny i kwasu gamma-aminomasłowego (GABA), zidentyfikowaliśmy dużą rodzinę pokrewnych produktów genów wyrażanych w mózgu gryzonia.
- Jeden z tych produktów hybrydyzuje z pojedynczym 3,7-kilozasadowym RNA ograniczonym do śródmózgowia i pnia mózgu szczura, gdzie jest wysoce wzbogacony w serotonergiczny kompleks raphe. <em>Transfekcja</em> pojedynczym komplementarnym klonem DNA pnia mózgu o masie 2,3 kilozasad wystarcza do wywołania ekspresji zależnego od Na(+) <em>5</em>transportera</em>HT na nienerwowym komórki, z transportem selektywnie i silnie antagonizowanym przez antydepresanty specyficzne dla wychwytu <em>5</em>HT, w tym paroksetynę, citalopram i fluoksetynę.
Transfekcja genów oparta na wektorach niewirusowych za pomocą indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych kardiomiocytów.
- Niewirusowa <em>transfekcja</em> ssaczych kardiomiocytów (CM) jest wyzwaniem. Obecne badanie ma na celu scharakteryzowanie i określenie wydajności <em>transfekcji</em> genu opartego na wektorach niewirusowych za pomocą indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM). hiPSC-
- CM odróżnione od PCBC hiPSC zostały wykorzystane jako model komórkowy do transfekcji plazmidami niosącymi białko zielonej fluorescencji (pGFP) przy użyciu polietylenoiminy (PEI), w tym <em>Transporter</em> <em>5</em> <em>Transfekcja </em> <em>Odczynnik</em> (TR<em>5</em>) i PEI2<em>5</em> oraz liposom, w tym lipofektamina-2000 (Lipo2K), lipofektamina-3000 (Lipo3K ) i Lipofectamine STEM (LipoSTEM).
- Wydajność <em>transfekcji</em> genu i żywotność komórek określono ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Odkryliśmy, że najwyższą skuteczność <em>transfekcji</em> genu w hiPSC-CMs w 14 dniu skurczu może osiągnąć LipoSTEM, która wyniosła około 32,<em>5</em> ± 6,7%. Spowodowało to jednak również słabą żywotność komórek (60,1 ± 4,<em>5</em>%).
- Co więcej, przedłużona hodowla (<em>transfekcja</em> w 23. dniu skurczu) hiPSC-CM nie tylko poprawiła <em>transfekcję</em> genu (<em>5</em>4.<em> 5</em> ± 8,9%, ale także zwiększona żywotność komórek (74 ± 4,9%) przez LipoSTEM.
- Na podstawie tego zoptymalizowanego warunku <em>transfekcji</em> genu najwyższa skuteczność <em>transfekcji</em> genu wyniosła <em>5</em><em>5</em>,6 ± 7,8% lub 34,1 ± 4% odpowiednio dla linii hiPSC P1C1 lub DP3 pochodzącej od zdrowego dawcy (P1C1) lub pacjenta z cukrzycą (DP3).
- Żywotność komórek wynosiła odpowiednio 80,8 ± <em>5</em> lub 92,9 ± 2,24% dla P1C1 lub DP3. LipoSTEM jest lepszym niewirusowym wektorem do <em>transfekcji</em> genów hiPSC-CM. Najwyższa skuteczność <em>transfekcji</em> genu pGFP może osiągnąć <em>5</em>0% w przypadku normalnych hiPSC-CM lub >30% w przypadku cukrzycowych hiPSC-CM.
Zależna od receptora N-metylo-D-asparaginianu regulacja transportera glutaminianu pobudzającego nośnika aminokwasu 1.
- Neuronowy <em>transport</em> pobudzający nośnik aminokwasów 1 (EAAC1) jest wzbogacony w regiony perysynaptyczne, gdzie może regulować synaptyczne wydzielanie glutaminianu. W tym badaniu zbadaliśmy potencjalne interakcje między EAAC1 a jonotropowymi receptorami glutaminianu. Podjednostki receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) NR1, NR2A i NR2B, ale nie podjednostki GluR2 receptora kwasu alfa-amino-3-hydroksy-<em>5-metylo-4-izoksazolo-propionowego poddano koimmunoprecypitacji z EAAC1 z hodowli hipokampa wzbogaconych w neurony.
- Podobną interakcję zaobserwowano w komórkach glejaka C6 i ludzkich embrionalnych komórkach nerki po ko<em>transfekcji</em> z podjednostkami EAAC1 i receptora NMDA znakowanymi epitopem Myc. Współ<em>transfekcja</em> glejaka C6 z kombinacją podjednostek NR1 i NR2 dramatycznie zwiększyła (około 3-krotnie) ilość Myc-EAAC1, którą można znakować nieprzepuszczalnym przez błony <em>odczynnikiem biotynylującym< /em>. W hodowlach hipokampa krótka (<em>5</em> min), silna (100 mikroM NMDA, 10 mikroM glicyny) aktywacja receptora NMDA zmniejszyła biotynylowany EAAC1 do około <em>5</em>0% poziomów kontrolnych .
- Efekt ten był hamowany przez antagonistę receptora NMDA, wewnątrzkomórkowe lub zewnątrzkomórkowe chelatory wapnia lub hipertoniczną sacharozę. Glutaminian, kwas alfa-amino-3-hydroksy-<em>5</em>-metylo-4-izoksazolopropionowy z cyklotiazydem i tapsigargina naśladowały działanie NMDA. Badania te sugerują, że receptory NMDA oddziałują z EAAC1, ułatwiają ekspresję EAAC1 na powierzchni komórki w warunkach podstawowych i kontrolują internalizację EAAC1 po aktywacji. Ta zależna od receptora NMDA regulacja EAAC1 zapewnia nowy mechanizm, który może kształtować sygnalizację pobudzającą podczas plastyczności synaptycznej i/lub ekscytotoksyczności.
Stabilna ekspresja transporterów amin biogennych ujawnia różnice we wrażliwości, kinetyce i zależności od jonów inhibitora.
- Skonstruowaliśmy stabilne linie komórkowe wyrażające <em>transportery</em> dopaminy (DA), norepinefryny (NE) i serotoniny (<em>5</em>-HT) poprzez <em>transfekcję</em> sklonowane cDNA. Komórka rodzicielska LLC-PK1 nie wyraża żadnego z tych <em>transporterów</em> neuroprzekaźników.
- Dlatego aktywność transportu monoamin w każdej z tych linii komórkowych wynika wyłącznie z transfekowanego DNA, co pozwala na porównanie na tym samym tle. Profile hamowania leków dla każdej linii komórkowej są różne i zgodne z oczekiwaniami dla każdego <em>transportera</em>.
- Komórki LLC-NET i LLC-DAT transportowały zarówno NE, jak i DA, a oba typy komórek wykazywały niższą KM dla transportu DA niż dla transportu NE.
- Analiza danych Vmax dla komórek LLC-NET sugeruje, że substrat jest związany z <em>transporterem</em> NE podczas etapu(ów) ograniczania szybkości transportu. Analog kokainy, 2-beta-karbometoksy-3-beta-(4-[12<l]jodofenylo)tropan wiąże się z każdym typem komórek i w każdym przypadku jest wypierany przez substrat transportowy.
- Pomiary wiązania i transportu w równoległych hodowlach komórkowych umożliwiły oszacowanie liczby obrotów dla <em>transporterów</em> noradrenaliny, dopaminy i serotoniny.
- Wszystkie trzy <em>transportery</em> wymagają zewnętrznego Na+ i Cl-. Zależność od stężenia Na+ sugeruje, że pojedynczy jon Na+ bierze udział w transporcie katalizowanym przez <em>transportery</em> noradrenaliny i serotoniny, podczas gdy więcej niż jeden jon Na+ bierze udział w transporcie za pośrednictwem <em>transportera</em> dopaminy.
Promotor pompy eksportu soli żółciowych człowieka jest transaktywowany przez receptor farnezoidowy X/receptor kwasu żółciowego.
- Pompa wydalnicza soli żółciowych (BSEP, ABCb11) ma kluczowe znaczenie dla zależnego od ATP transportu kwasów żółciowych przez błonę kanalikową hepatocytów i do wytwarzania zależnego od kwasów żółciowych wydzielania żółci. Ostatnie badania wykazały, że ekspresja tego <em>transportera</em> jest wrażliwa na przepływ kwasów żółciowych przez hepatocyt, prawdopodobnie na poziomie transkrypcji genu BSEP.
- Aby określić mechanizmy leżące u podstaw regulacji BSEP przez kwasy żółciowe, sklonowano promotor genu BSEP. Sekwencja promotora zawierała element odwróconego powtórzenia (IR)-1 (<em>5</em>’-GGGACA TGATCCT-3′) w parach zasad -63/-<em>5</em>0 składający się z dwóch połówkowych miejsc receptora jądrowego zorganizowanych jako odwrócone powtórzenie i oddzielonych pojedynczym nukleotydem.
- W kilku ostatnich badaniach wykazano, że ten element IR-1 służy jako miejsce wiązania dla receptora farnezoidowego X (FXR), jądrowego receptora kwasów żółciowych. Aktywność FXR wymaga heterodimeryzacji z RXR alfa, a po związaniu przez kwasy żółciowe kompleks skutecznie reguluje transkrypcję kilku genów zaangażowanych w homeostazę kwasów żółciowych.
- Testy przesunięcia ruchliwości żelu wykazały specyficzne wiązanie heterodimerów FXR/RXR alfa z elementem IR-1 w promotorze BSEP. W komórkach HepG2 do osiągnięcia pełnej transaktywacji promotora BSEP przez kwasy żółciowe wymagana jest ko<em>transfekcja</em> FXR i RXR alfa.
- Dwa mutanty z niedoborem transaktywacji FXR (delecja AF-2 i mutant punktowy W469A) nie uległy transaktywacji, co wskazuje, że wpływ kwasów żółciowych jest zależny od FXR. Ponadto analiza mutacji potwierdza, że heterodimer FXR/RXR alfa aktywuje transkrypcję przez miejsce IR-1 w ludzkim promotorze BSEP.
PureFection™ Transfection reagent |
|||
| LV750A-5 | SBI | 5 ml | 1366 EUR |
HighGene transfection reagent |
|||
| RM09014 | Abclonal | 1000μl | 270 EUR |
LP4K Transfection Reagent |
|||
| LP4K | GenTarget | 1.0 ml / vial | 304 EUR |
Convoy? Transfection Reagent |
|||
| 1110-1ml | ACTGene | 341 EUR | |
EL Transfection Reagent |
|||
| 20-abx098880 | Abbexa |
|
|
PureFection Transfection Reagent |
|||
| LV750A-1 | SBI | 1 ml | 359 EUR |
ExFect2000 Transfection Reagent |
|||
| T202-01 | Vazyme | 0.5 ml | 227 EUR |
ExFect2000 Transfection Reagent |
|||
| T202-02 | Vazyme | 1 ml | 316 EUR |
ExFect2000 Transfection Reagent |
|||
| T202-03 | Vazyme | 5 ml | 1052 EUR |
Lentifectin (TM) Transfection Reagent |
|||
| DNAF003 | Bio Basic | 1ml | 278.81 EUR |
iMFectin DNA Transfection Reagent |
|||
| I7100-100 | GenDepot | 100ul | 147 EUR |
iMFectin DNA Transfection Reagent |
|||
| I7100-101 | GenDepot | 1ml | 442 EUR |
iMFectin DNA Transfection Reagent |
|||
| I7100-105 | GenDepot | 5x1ml | 1873 EUR |
iMFectin DNA Transfection Reagent |
|||
| I7100-120 | GenDepot | 20ml | 6787 EUR |
Transfection Reagent (1 mL) |
|||
| P901 | 101Bio | - | Ask for price |
Transfection Reagent (0.1 mL) |
|||
| P901S | 101Bio | - | Ask for price |
Sapphire Insect Transfection Reagent |
|||
| ABP-BVD-10003 | Allele Biotech | 75ul, 25 transfections | Ask for price |
GeneGlide? DNA Transfection Reagent |
|||
| M1080-1000 | Biovision | 530 EUR | |
GeneGlide? DNA Transfection Reagent |
|||
| M1080-300 | Biovision | 269 EUR | |
GeneGlide? DNA Transfection Reagent |
|||
| M1080-500 | Biovision | 361 EUR | |
GeneGlide? siRNA Transfection Reagent |
|||
| M1081-1000 | Biovision | 445 EUR | |
GeneGlide? siRNA Transfection Reagent |
|||
| M1081-300 | Biovision | 265 EUR | |
GeneGlide? siRNA Transfection Reagent |
|||
| M1081-500 | Biovision | 304 EUR | |
iMFectin Poly DNA Transfection Reagent |
|||
| I7200-100 | GenDepot | 100ul | 147 EUR |
iMFectin Poly DNA Transfection Reagent |
|||
| I7200-101 | GenDepot | 1ml | 442 EUR |
iMFectin Poly DNA Transfection Reagent |
|||
| I7200-105 | GenDepot | 5x1ml | 1873 EUR |
iMFectin Poly DNA Transfection Reagent |
|||
| I7200-120 | GenDepot | 20ml | 6787 EUR |
iMFectin 2000 DNA Transfection Reagent |
|||
| I7300-101 | GenDepot | 1ml | Ask for price |
iMFectin 2000 DNA Transfection Reagent |
|||
| I7300-105 | GenDepot | 5x1ml | Ask for price |
T-Pro P-Fect Transfection Reagent |
|||
| JT97-N005M | T-Pro Biotechnology | 1.0ml/vial | 222 EUR |
RNAfection, RNA transfection reagent 50 ul |
|||
| MR750A-1 | SBI | 50 ul | 210 EUR |
T-Pro Nonliposomal Transfection Reagent I (NTR I) |
|||
| JT97-N001M | T-Pro Biotechnology | 1.0ml/vial | 187 EUR |
T-Pro Nonliposomal Transfection Reagent II (NTR II) |
|||
| JT97-N002M | T-Pro Biotechnology | 1.0ml/vial | 204 EUR |
T-Pro Nonliposomal Transfection Reagent III (NTR III) |
|||
| JT97-N006M | T-Pro Biotechnology | 1.0ml/vial | 222 EUR |
BOP reagent |
|||
| 5-02141 | CHI Scientific | 25g | Ask for price |
BOP reagent |
|||
| 5-02142 | CHI Scientific | 100g | Ask for price |
BODIPY-Acetylene Reagent |
|||
| 2594-5 | Biovision | 675 EUR | |
ExoPure? Reagent (Overall Exosome Isolation, biological fluids) |
|||
| M1001-5 | Biovision | 528 EUR | |
FBS, Transfection Optimized |
|||
| F0640-050 | GenDepot | 500ml | 752 EUR |
Bovine Serum Albumin ? Heat Shock, Reagent Grade, pH 7.0 |
|||
| 7917-5 | Biovision | 120 EUR | |
Beaucage reagent |
|||
| HY-100951 | MedChemExpress | 10mM/1mL | 126 EUR |
Bradford reagent |
|||
| BDE641 | Bio Basic | 100ml | 61.01 EUR |
BOP reagent |
|||
| A7015-100000 | ApexBio | 100 g | 200 EUR |
BOP reagent |
|||
| A7015-25000 | ApexBio | 25 g | 113 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT030 | ScyTek Laboratories | 30 ml | 60 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT125 | ScyTek Laboratories | 125 ml | 63 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT3800 | ScyTek Laboratories | 1 Gal. | 184 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT500 | ScyTek Laboratories | 500 ml | 76 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT999 | ScyTek Laboratories | 1000 ml | 88 EUR |
Chymase reagent |
|||
| 30C-CP1129 | Fitzgerald | 5 units | 2185 EUR |
Traut's Reagent |
|||
| 2330-1000 | Biovision | 349 EUR | |
Traut's Reagent |
|||
| 2330-500 | Biovision | 207 EUR | |
MTS Reagent |
|||
| 2808-1000 | Biovision | 990 EUR | |
MTS Reagent |
|||
| 2808-250 | Biovision | 365 EUR | |
MTT Reagent |
|||
| 2809-1G | Biovision | 180 EUR | |
MTT Reagent |
|||
| 2809-5G | Biovision | 544 EUR | |
Protoplast Solution for Transfection |
|||
| GR103052 | Genorise Scientific | 10 mL | 119 EUR |
Calcium Phosphate Transfection Kit |
|||
| GR103070 | Genorise Scientific | 100 preps | 219 EUR |
Zinc Transporter 5 (Znt5) Antibody |
|||
| abx239748-100ug | Abbexa | 100 ug | 509 EUR |
anti-Glucose Transporter 5 GLUT5 |
|||
| YF-PA14669 | Abfrontier | 50 ug | 363 EUR |
REAGENT RESERV, 50ML,WHITE,PS,S,BK,5/200 |
|||
| 4870 | CORNING | 5/pk | 190 EUR |
REAGENT RESERV,100ML,WHT,PS,S,BK,5/200 |
|||
| 4872 | CORNING | 5/pk | 224 EUR |
IL-8 (-5 to +5) |
|||
| 5-01377 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
BCA Reagent, 16ML |
|||
| C144-16ML | Arbor Assays | 16ML | 163 EUR |
Dissociation Reagent, 1ML |
|||
| X017-1ML | Arbor Assays | 1ML | 109 EUR |
Dissociation Reagent, 25ML |
|||
| X017-25ML | Arbor Assays | 25ML | 258 EUR |
Dissociation Reagent, 5ML |
|||
| X017-5ML | Arbor Assays | 5ML | 122 EUR |
Dissociation Reagent, 1ML |
|||
| X058-1ML | Arbor Assays | 1ML | 73 EUR |
Dissociation Reagent, 5ML |
|||
| X058-5ML | Arbor Assays | 5ML | 109 EUR |
Biolipidure-1002-Reagent |
|||
| Biolipidure-1002-10 | Cusabio | 10mL | 196 EUR |
n-Heptane Reagent |
|||
| HC5400 | Bio Basic | 1L | 79 EUR |
Tri-RNA Reagent |
|||
| FATRR-001 | Favorgen | 100ml | 236 EUR |
Tri-RNA Reagent |
|||
| FATRR-002 | Favorgen | 50ml | 176 EUR |
Tri-RNA Reagent |
|||
| FATRR-003 | Favorgen | 450ml | 645 EUR |
DTT (Cleland's reagent) |
|||
| DB0058 | Bio Basic | 5g | 84.8 EUR |
DTNB (Ellman's Reagent) |
|||
| DB0113 | Bio Basic | 5g | 97.85 EUR |
Ethyl acetate Reagent |
|||
| EC4600 | Bio Basic | 1L | 79 EUR |
TissueDigest Reagent, 20X |
|||
| T101 | Insitus Biotechnologies | 10ml | 210 EUR |
Griess Reagent Kit |
|||
| 30100 | Biotium | 1KIT | 149 EUR |
PhosphoBlocker Blocking Reagent |
|||
| AKR-103 | Cell Biolabs | 1L | 328 EUR |
PhosphoBlocker Blocking Reagent |
|||
| AKR-104 | Cell Biolabs | 4L | 711 EUR |
Mycoplasma Prevention Reagent |
|||
| 20-abx098886 | Abbexa |
|
|
Girard's reagent T |
|||
| 20-abx184099 | Abbexa |
|
|
FcR blocking Reagent |
|||
| 20-abx290024 | Abbexa |
|
|
Detection Reagent A |
|||
| abx296004-120ul | Abbexa | 120 ul | 321 EUR |
Mycoplasma Prevention Reagent |
|||
| 20-abx298005 | Abbexa |
|
|
Biolipidure-1002-Reagent |
|||
| Biolipidure-1002-100 | Biolipidure | 100mL | 1223 EUR |
Biolipidure-103-Reagent |
|||
| Biolipidure-103-10 | Biolipidure | 10mL | 196 EUR |
Biolipidure-103-Reagent |
|||
| Biolipidure-103-100 | Biolipidure | 100mL | 1223 EUR |
Biolipidure-1201-Reagent |
|||
| Biolipidure-1201-10 | Biolipidure | 10mL | 196 EUR |
Biolipidure-1201-Reagent |
|||
| Biolipidure-1201-100 | Biolipidure | 100mL | 1223 EUR |
Biolipidure-1301-Reagent |
|||
| Biolipidure-1301-10 | Biolipidure | 10mL | 196 EUR |
Biolipidure-1301-Reagent |
|||
| Biolipidure-1301-100 | Biolipidure | 100mL | 1223 EUR |
Biolipidure-203-Reagent |
|||
| Biolipidure-203-10 | Biolipidure | 10mL | 196 EUR |
Biolipidure-203-Reagent |
|||
| Biolipidure-203-100 | Biolipidure | 100mL | 1223 EUR |
Biolipidure-206-Reagent |
|||
| Biolipidure-206-10 | Biolipidure | 10mL | 196 EUR |
Biolipidure-206-Reagent |
|||
| Biolipidure-206-100 | Biolipidure | 100mL | 1223 EUR |
Biolipidure-405-Reagent |
|||
| Biolipidure-405-10 | Biolipidure | 10mL | 196 EUR |
Biolipidure-405-Reagent |
|||
| Biolipidure-405-100 | Biolipidure | 100mL | 1223 EUR |
Biolipidure-502-Reagent |
|||
| Biolipidure-502-10 | Biolipidure | 10mL | 196 EUR |
Wyniki te pokazują mechanizm, za pomocą którego kwasy żółciowe regulują transkrypcyjnie aktywność pompy wydalniczej soli żółciowych, krytycznego składnika zaangażowanego w krążenie jelitowo-wątrobowe kwasów żółciowych.
