- Selektywny antagonizm transportu serotoniny (<em>5</em>-hydroksytryptaminy, <em>5</em>HT) i noradrenaliny przez leki przeciwdepresyjne jest kluczowym elementem hipotezy „aminy” dotyczącej zaburzeń afektywnych. Doniesiono, że miejsca wychwytu i/lub transportu <em>5</em>HT są zmniejszone w płytkach krwi pacjentów cierpiących na depresję oraz w pobranych pośmiertnie próbkach mózgów pacjentów z depresją i ofiar samobójstw.
- Do tej pory dostępnych było niewiele informacji molekularnych na temat struktury i regulacji <em>5</em>HT <em>transporterów</em>. Stosując reakcję łańcuchową polimerazy ze zdegenerowanymi oligonukleotydami pochodzącymi z dwóch wysoce konserwatywnych regionów <em>transporterów</em> noradrenaliny i kwasu gamma-aminomasłowego (GABA), zidentyfikowaliśmy dużą rodzinę pokrewnych produktów genów wyrażanych w mózgu gryzonia.
- Jeden z tych produktów hybrydyzuje z pojedynczym 3,7-kilozasadowym RNA ograniczonym do śródmózgowia i pnia mózgu szczura, gdzie jest wysoce wzbogacony w serotonergiczny kompleks raphe. <em>Transfekcja</em> pojedynczym komplementarnym klonem DNA pnia mózgu o masie 2,3 kilozasad wystarcza do wywołania ekspresji zależnego od Na(+) <em>5</em>transportera</em>HT na nienerwowym komórki, z transportem selektywnie i silnie antagonizowanym przez antydepresanty specyficzne dla wychwytu <em>5</em>HT, w tym paroksetynę, citalopram i fluoksetynę.
Transfekcja genów oparta na wektorach niewirusowych za pomocą indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych kardiomiocytów.
- Niewirusowa <em>transfekcja</em> ssaczych kardiomiocytów (CM) jest wyzwaniem. Obecne badanie ma na celu scharakteryzowanie i określenie wydajności <em>transfekcji</em> genu opartego na wektorach niewirusowych za pomocą indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM). hiPSC-
- CM odróżnione od PCBC hiPSC zostały wykorzystane jako model komórkowy do transfekcji plazmidami niosącymi białko zielonej fluorescencji (pGFP) przy użyciu polietylenoiminy (PEI), w tym <em>Transporter</em> <em>5</em> <em>Transfekcja </em> <em>Odczynnik</em> (TR<em>5</em>) i PEI2<em>5</em> oraz liposom, w tym lipofektamina-2000 (Lipo2K), lipofektamina-3000 (Lipo3K ) i Lipofectamine STEM (LipoSTEM).
- Wydajność <em>transfekcji</em> genu i żywotność komórek określono ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Odkryliśmy, że najwyższą skuteczność <em>transfekcji</em> genu w hiPSC-CMs w 14 dniu skurczu może osiągnąć LipoSTEM, która wyniosła około 32,<em>5</em> ± 6,7%. Spowodowało to jednak również słabą żywotność komórek (60,1 ± 4,<em>5</em>%).
- Co więcej, przedłużona hodowla (<em>transfekcja</em> w 23. dniu skurczu) hiPSC-CM nie tylko poprawiła <em>transfekcję</em> genu (<em>5</em>4.<em> 5</em> ± 8,9%, ale także zwiększona żywotność komórek (74 ± 4,9%) przez LipoSTEM.
- Na podstawie tego zoptymalizowanego warunku <em>transfekcji</em> genu najwyższa skuteczność <em>transfekcji</em> genu wyniosła <em>5</em><em>5</em>,6 ± 7,8% lub 34,1 ± 4% odpowiednio dla linii hiPSC P1C1 lub DP3 pochodzącej od zdrowego dawcy (P1C1) lub pacjenta z cukrzycą (DP3).
- Żywotność komórek wynosiła odpowiednio 80,8 ± <em>5</em> lub 92,9 ± 2,24% dla P1C1 lub DP3. LipoSTEM jest lepszym niewirusowym wektorem do <em>transfekcji</em> genów hiPSC-CM. Najwyższa skuteczność <em>transfekcji</em> genu pGFP może osiągnąć <em>5</em>0% w przypadku normalnych hiPSC-CM lub >30% w przypadku cukrzycowych hiPSC-CM.
Zależna od receptora N-metylo-D-asparaginianu regulacja transportera glutaminianu pobudzającego nośnika aminokwasu 1.
- Neuronowy <em>transport</em> pobudzający nośnik aminokwasów 1 (EAAC1) jest wzbogacony w regiony perysynaptyczne, gdzie może regulować synaptyczne wydzielanie glutaminianu. W tym badaniu zbadaliśmy potencjalne interakcje między EAAC1 a jonotropowymi receptorami glutaminianu. Podjednostki receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) NR1, NR2A i NR2B, ale nie podjednostki GluR2 receptora kwasu alfa-amino-3-hydroksy-<em>5-metylo-4-izoksazolo-propionowego poddano koimmunoprecypitacji z EAAC1 z hodowli hipokampa wzbogaconych w neurony.
- Podobną interakcję zaobserwowano w komórkach glejaka C6 i ludzkich embrionalnych komórkach nerki po ko<em>transfekcji</em> z podjednostkami EAAC1 i receptora NMDA znakowanymi epitopem Myc. Współ<em>transfekcja</em> glejaka C6 z kombinacją podjednostek NR1 i NR2 dramatycznie zwiększyła (około 3-krotnie) ilość Myc-EAAC1, którą można znakować nieprzepuszczalnym przez błony <em>odczynnikiem biotynylującym< /em>. W hodowlach hipokampa krótka (<em>5</em> min), silna (100 mikroM NMDA, 10 mikroM glicyny) aktywacja receptora NMDA zmniejszyła biotynylowany EAAC1 do około <em>5</em>0% poziomów kontrolnych .
- Efekt ten był hamowany przez antagonistę receptora NMDA, wewnątrzkomórkowe lub zewnątrzkomórkowe chelatory wapnia lub hipertoniczną sacharozę. Glutaminian, kwas alfa-amino-3-hydroksy-<em>5</em>-metylo-4-izoksazolopropionowy z cyklotiazydem i tapsigargina naśladowały działanie NMDA. Badania te sugerują, że receptory NMDA oddziałują z EAAC1, ułatwiają ekspresję EAAC1 na powierzchni komórki w warunkach podstawowych i kontrolują internalizację EAAC1 po aktywacji. Ta zależna od receptora NMDA regulacja EAAC1 zapewnia nowy mechanizm, który może kształtować sygnalizację pobudzającą podczas plastyczności synaptycznej i/lub ekscytotoksyczności.
Stabilna ekspresja transporterów amin biogennych ujawnia różnice we wrażliwości, kinetyce i zależności od jonów inhibitora.
- Skonstruowaliśmy stabilne linie komórkowe wyrażające <em>transportery</em> dopaminy (DA), norepinefryny (NE) i serotoniny (<em>5</em>-HT) poprzez <em>transfekcję</em> sklonowane cDNA. Komórka rodzicielska LLC-PK1 nie wyraża żadnego z tych <em>transporterów</em> neuroprzekaźników.
- Dlatego aktywność transportu monoamin w każdej z tych linii komórkowych wynika wyłącznie z transfekowanego DNA, co pozwala na porównanie na tym samym tle. Profile hamowania leków dla każdej linii komórkowej są różne i zgodne z oczekiwaniami dla każdego <em>transportera</em>.
- Komórki LLC-NET i LLC-DAT transportowały zarówno NE, jak i DA, a oba typy komórek wykazywały niższą KM dla transportu DA niż dla transportu NE.
- Analiza danych Vmax dla komórek LLC-NET sugeruje, że substrat jest związany z <em>transporterem</em> NE podczas etapu(ów) ograniczania szybkości transportu. Analog kokainy, 2-beta-karbometoksy-3-beta-(4-[12<l]jodofenylo)tropan wiąże się z każdym typem komórek i w każdym przypadku jest wypierany przez substrat transportowy.
- Pomiary wiązania i transportu w równoległych hodowlach komórkowych umożliwiły oszacowanie liczby obrotów dla <em>transporterów</em> noradrenaliny, dopaminy i serotoniny.
- Wszystkie trzy <em>transportery</em> wymagają zewnętrznego Na+ i Cl-. Zależność od stężenia Na+ sugeruje, że pojedynczy jon Na+ bierze udział w transporcie katalizowanym przez <em>transportery</em> noradrenaliny i serotoniny, podczas gdy więcej niż jeden jon Na+ bierze udział w transporcie za pośrednictwem <em>transportera</em> dopaminy.
Promotor pompy eksportu soli żółciowych człowieka jest transaktywowany przez receptor farnezoidowy X/receptor kwasu żółciowego.
- Pompa wydalnicza soli żółciowych (BSEP, ABCb11) ma kluczowe znaczenie dla zależnego od ATP transportu kwasów żółciowych przez błonę kanalikową hepatocytów i do wytwarzania zależnego od kwasów żółciowych wydzielania żółci. Ostatnie badania wykazały, że ekspresja tego <em>transportera</em> jest wrażliwa na przepływ kwasów żółciowych przez hepatocyt, prawdopodobnie na poziomie transkrypcji genu BSEP.
- Aby określić mechanizmy leżące u podstaw regulacji BSEP przez kwasy żółciowe, sklonowano promotor genu BSEP. Sekwencja promotora zawierała element odwróconego powtórzenia (IR)-1 (<em>5</em>’-GGGACA TGATCCT-3′) w parach zasad -63/-<em>5</em>0 składający się z dwóch połówkowych miejsc receptora jądrowego zorganizowanych jako odwrócone powtórzenie i oddzielonych pojedynczym nukleotydem.
- W kilku ostatnich badaniach wykazano, że ten element IR-1 służy jako miejsce wiązania dla receptora farnezoidowego X (FXR), jądrowego receptora kwasów żółciowych. Aktywność FXR wymaga heterodimeryzacji z RXR alfa, a po związaniu przez kwasy żółciowe kompleks skutecznie reguluje transkrypcję kilku genów zaangażowanych w homeostazę kwasów żółciowych.
- Testy przesunięcia ruchliwości żelu wykazały specyficzne wiązanie heterodimerów FXR/RXR alfa z elementem IR-1 w promotorze BSEP. W komórkach HepG2 do osiągnięcia pełnej transaktywacji promotora BSEP przez kwasy żółciowe wymagana jest ko<em>transfekcja</em> FXR i RXR alfa.
- Dwa mutanty z niedoborem transaktywacji FXR (delecja AF-2 i mutant punktowy W469A) nie uległy transaktywacji, co wskazuje, że wpływ kwasów żółciowych jest zależny od FXR. Ponadto analiza mutacji potwierdza, że heterodimer FXR/RXR alfa aktywuje transkrypcję przez miejsce IR-1 w ludzkim promotorze BSEP.
PureFection™ Transfection reagent |
|||
| LV750A-5 | SBI | 5 ml | 1639.2 EUR |
Convoy? Transfection Reagent |
|||
| 1110-1ml | ACTGene | 409.2 EUR | |
EL Transfection Reagent |
|||
| 20-abx098880 | Abbexa |
|
|
LP4K Transfection Reagent |
|||
| LP4K | GenTarget | 1.0 ml / vial | 364.8 EUR |
PureFection Transfection Reagent |
|||
| LV750A-1 | SBI | 1 ml | 430.8 EUR |
ExFect2000 Transfection Reagent |
|||
| T202-01 | Vazyme | 0.5 ml | 272.4 EUR |
ExFect2000 Transfection Reagent |
|||
| T202-02 | Vazyme | 1 ml | 379.2 EUR |
ExFect2000 Transfection Reagent |
|||
| T202-03 | Vazyme | 5 ml | 1262.4 EUR |
HighGene transfection reagent |
|||
| RM09014 | Abclonal | 1000μl | 324 EUR |
Lentifectin (TM) Transfection Reagent |
|||
| DNAF003 | Bio Basic | 1ml | 334.57 EUR |
Sapphire Insect Transfection Reagent |
|||
| ABP-BVD-10003 | Allele Biotech | 75ul, 25 transfections | Ask for price |
GeneGlide? DNA Transfection Reagent |
|||
| M1080-1000 | Biovision | 636 EUR | |
GeneGlide? DNA Transfection Reagent |
|||
| M1080-300 | Biovision | 322.8 EUR | |
GeneGlide? DNA Transfection Reagent |
|||
| M1080-500 | Biovision | 433.2 EUR | |
GeneGlide? siRNA Transfection Reagent |
|||
| M1081-1000 | Biovision | 534 EUR | |
GeneGlide? siRNA Transfection Reagent |
|||
| M1081-300 | Biovision | 318 EUR | |
GeneGlide? siRNA Transfection Reagent |
|||
| M1081-500 | Biovision | 364.8 EUR | |
Transfection Reagent (1 mL) |
|||
| P901 | 101Bio | - | Ask for price |
Transfection Reagent (0.1 mL) |
|||
| P901S | 101Bio | - | Ask for price |
iMFectin DNA Transfection Reagent |
|||
| I7100-100 | GenDepot | 100ul | 176.4 EUR |
iMFectin DNA Transfection Reagent |
|||
| I7100-101 | GenDepot | 1ml | 530.4 EUR |
iMFectin DNA Transfection Reagent |
|||
| I7100-105 | GenDepot | 5x1ml | 2247.6 EUR |
iMFectin DNA Transfection Reagent |
|||
| I7100-120 | GenDepot | 20ml | 8144.4 EUR |
iMFectin Poly DNA Transfection Reagent |
|||
| I7200-100 | GenDepot | 100ul | 176.4 EUR |
iMFectin Poly DNA Transfection Reagent |
|||
| I7200-101 | GenDepot | 1ml | 530.4 EUR |
iMFectin Poly DNA Transfection Reagent |
|||
| I7200-105 | GenDepot | 5x1ml | 2247.6 EUR |
iMFectin Poly DNA Transfection Reagent |
|||
| I7200-120 | GenDepot | 20ml | 8144.4 EUR |
iMFectin 2000 DNA Transfection Reagent |
|||
| I7300-101 | GenDepot | 1ml | Ask for price |
iMFectin 2000 DNA Transfection Reagent |
|||
| I7300-105 | GenDepot | 5x1ml | Ask for price |
Transfectamine™ 5000 Transfection Reagent |
|||
| 60020 | AAT Bioquest | 0.5 mL | 222 EUR |
Transfectamine™ 5000 Transfection Reagent |
|||
| 60021 | AAT Bioquest | 1 mL | 334 EUR |
Transfectamine™ 5000 Transfection Reagent |
|||
| 60022 | AAT Bioquest | 5 mL | 846 EUR |
Transfectamine™ mRNA Transfection Reagent |
|||
| 60030 | AAT Bioquest | 500 ul | 203 EUR |
Transfectamine™ mRNA Transfection Reagent |
|||
| 60031 | AAT Bioquest | 5 ml | 989 EUR |
RNAfection, RNA transfection reagent 50 ul |
|||
| MR750A-1 | SBI | 50 ul | 252 EUR |
T-Pro P-Fect Transfection Reagent |
|||
| JT97-N005M | T-Pro Biotechnology | 1.0ml/vial | 266.4 EUR |
T-Pro Nonliposomal Transfection Reagent I (NTR I) |
|||
| JT97-N001M | T-Pro Biotechnology | 1.0ml/vial | 224.4 EUR |
T-Pro Nonliposomal Transfection Reagent II (NTR II) |
|||
| JT97-N002M | T-Pro Biotechnology | 1.0ml/vial | 244.8 EUR |
T-Pro Nonliposomal Transfection Reagent III (NTR III) |
|||
| JT97-N006M | T-Pro Biotechnology | 1.0ml/vial | 266.4 EUR |
BOP reagent |
|||
| 5-02141 | CHI Scientific | 25g | Ask for price |
BOP reagent |
|||
| 5-02142 | CHI Scientific | 100g | Ask for price |
BODIPY-Acetylene Reagent |
|||
| 2594-5 | Biovision | 810 EUR | |
FBS, Transfection Optimized |
|||
| F0640-050 | GenDepot | 500ml | 902.4 EUR |
ExoPure? Reagent (Overall Exosome Isolation, biological fluids) |
|||
| M1001-5 | Biovision | 633.6 EUR | |
EP Reagent Biuret Reagent |
|||
| 1011601 | Scientific Laboratory Supplies | 1L | 42.18 EUR |
EP Reagent Iodoplatinate Reagent |
|||
| 1046300 | Scientific Laboratory Supplies | 200ML | 360.24 EUR |
EP Reagent Methoxyphenylacetic Reagent |
|||
| 1053601 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 354.54 EUR |
EP Reagent Molybdovanadic Reagent |
|||
| 1056700 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 42.18 EUR |
EP Reagent Phosphomolybdotungstic Reagent |
|||
| 1065000 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 161.88 EUR |
Costar 50mL Reagent Reservoirs 5/Bag Sterile |
|||
| 4870 | Scientific Laboratory Supplies | PK200 | 279.3 EUR |
Costar 100mL Reagent Reservoirs 5/Bag Sterile |
|||
| 4872 | Scientific Laboratory Supplies | PK200 | 334.02 EUR |
Protoplast Solution for Transfection |
|||
| GR103052 | Genorise Scientific | 10 mL | 142.8 EUR |
Calcium Phosphate Transfection Kit |
|||
| GR103070 | Genorise Scientific | 100 preps | 262.8 EUR |
EP Reagent Sulfomolybdic Reagent R3 |
|||
| 1086500 | Scientific Laboratory Supplies | 1L | 287.28 EUR |
Zinc Transporter 5 (Znt5) Antibody |
|||
| abx239748-100ug | Abbexa | 100 ug | 610.8 EUR |
anti-Glucose Transporter 5 GLUT5 |
|||
| YF-PA14669 | Abfrontier | 50 ug | 435.6 EUR |
GLUT5 Antibody (Glucose transporter 5) |
|||
| R30827 | NSJ Bioreagents | 100 ug | 419 EUR |
GLUT5 Antibody (Glucose Transporter 5) |
|||
| R31175 | NSJ Bioreagents | 100 ug | 419 EUR |
Bovine Serum Albumin ? Heat Shock, Reagent Grade, pH 7.0 |
|||
| 7917-5 | Biovision | 144 EUR | |
IL-8 (-5 to +5) |
|||
| 5-01377 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Bluing Reagent |
|||
| BRT030 | ScyTek Laboratories | 30 ml | 72 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT125 | ScyTek Laboratories | 125 ml | 75.6 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT3800 | ScyTek Laboratories | 1 Gal. | 220.8 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT500 | ScyTek Laboratories | 500 ml | 91.2 EUR |
Bluing Reagent |
|||
| BRT999 | ScyTek Laboratories | 1000 ml | 105.6 EUR |
Chymase reagent |
|||
| 30C-CP1129 | Fitzgerald | 5 units | 2622 EUR |
Traut's Reagent |
|||
| 2330-1000 | Biovision | 418.8 EUR | |
Traut's Reagent |
|||
| 2330-500 | Biovision | 248.4 EUR | |
MTS Reagent |
|||
| 2808-1000 | Biovision | 1188 EUR | |
MTS Reagent |
|||
| 2808-250 | Biovision | 438 EUR | |
MTT Reagent |
|||
| 2809-1G | Biovision | 216 EUR | |
MTT Reagent |
|||
| 2809-5G | Biovision | 652.8 EUR | |
BOP reagent |
|||
| A7015-100000 | ApexBio | 100 g | 240 EUR |
BOP reagent |
|||
| A7015-25000 | ApexBio | 25 g | 135.6 EUR |
Bradford reagent |
|||
| BDE641 | Bio Basic | 100ml | 73.21 EUR |
Beaucage reagent |
|||
| HY-100951 | MedChemExpress | 10mM/1mL | 151.2 EUR |
Ninhydrin Reagent |
|||
| MIC6746 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 31.12 EUR |
Nessler Reagent |
|||
| NESSR | Scientific Laboratory Supplies | 500ML | 148.2 EUR |
Phosphate Reagent |
|||
| 106199 | Scientific Laboratory Supplies | PK100 | 61.29 EUR |
Chromium Reagent |
|||
| 1206699 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 141.72 EUR |
Thioacetamide Reagent |
|||
| THIOR01 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 78.66 EUR |
Exo-Fect Exosome Transfection Kit |
|||
| EXFT10A-1 | SBI | 10 reactions | 351.6 EUR |
Exo-Fect Exosome Transfection Kit |
|||
| EXFT20A-1 | SBI | 20 reactions | 586.8 EUR |
293T Transfection Kit (1 mL) |
|||
| P902 | 101Bio | - | Ask for price |
293T Transfection Kit (0.2 mL) |
|||
| P902S | 101Bio | - | Ask for price |
293T Transfection Kit (1 mL) |
|||
| P903 | 101Bio | - | Ask for price |
293T Transfection Kit (0.2 mL) |
|||
| P903S | 101Bio | - | Ask for price |
Phosphate-buffered Sucrose for Transfection |
|||
| GR103050 | Genorise Scientific | 1 L | 142.8 EUR |
Plant Electroporation Buffer for Transfection |
|||
| GR103051 | Genorise Scientific | 1 L | 142.8 EUR |
2',3',5'-triacetyl-5-Azacytidine |
|||
| C4119-5 | ApexBio | 5 mg | 141.6 EUR |
2',3',5'-triacetyl-5-Azacytidine |
|||
| B2822-5 | Biovision | 183.6 EUR | |
Histatin 5 |
|||
| 5-01307 | CHI Scientific | 4 x 1mg | Ask for price |
Necrostatin-5 |
|||
| 1865-5 | Biovision | 151.2 EUR | |
Aftin-5 |
|||
| 2575-5 | Biovision | 548.4 EUR | |
CHD-5 |
|||
| 2693-5 | Biovision | 183.6 EUR | |
5-Iodotubercidin |
|||
| A3125-5 | ApexBio | 5 mg | 201.6 EUR |
5-ROX |
|||
| B8212-5 | ApexBio | 5 mg | 234 EUR |
GNF-5 |
|||
| B1329-5 | Biovision | 170.4 EUR | |
Thrombin Receptor Activator for Peptide 5 (TRAP-5) |
|||
| A1036-5 | ApexBio | 5 mg | 122.4 EUR |
Teicoplanin A2-5 |
|||
| C4938-5 | ApexBio | 5 mg | 1388.4 EUR |
Wyniki te pokazują mechanizm, za pomocą którego kwasy żółciowe regulują transkrypcyjnie aktywność pompy wydalniczej soli żółciowych, krytycznego składnika zaangażowanego w krążenie jelitowo-wątrobowe kwasów żółciowych.
