Prowadzenie kolumny DEAE

Wymagane rozwiązania
~ 100 ml 40 mM Tris, pH 7,8

~ 60 ml 40 mM Tris, pH 7,8 + 0,6 M NaCl

W zależności od tego, jak mocno twoje białko jest związane, możesz użyć wyższej molarności NaCl do drugiego roztworu

Próbki do dializy
Mieszać w zimnym pomieszczeniu
Zmień zewnętrzny bufor przed wyjazdem (powinien był mieszać co najmniej godzinę)
Następnego dnia ponownie zmień bufor zewnętrzny i mieszaj przez co najmniej godzinę
Odkręć dializowane próbki, aby upewnić się, że nie ma osadu
Jeśli jest osad, zawieś go ponownie w roztworze o wysokiej zawartości soli i rozprowadź trochę na żelu
Resztę wlej do kolumny

Przygotuj kolumnę
Wlej 8 ml kulek do probówki
Umyć 3x wodą, 1x tylko Tris, 1x Tris + wysoka sól
Nałóż wystarczającą ilość roztworu Tylko Tris '', aby ponownie zawiesić kulki (~ 16 ml, jeśli 8 ml kulek) wlać do kolumny i puścić Wlej trochę roztworu Tylko Tris ” i pozwól, aby kolumna popłynęła trochę w tej samej probówce, do której trafiły próbki
Przeprowadź część tej próbki na żelu
Przepuszczać roztwór “ Tylko Tris ” przez kolumnę , aż OD280 spadnie do ~ 0,02 do 0,01.
Rozpocznij gradient (roztwór o wysokiej zawartości soli po lewej stronie, roztwór o niskiej zawartości soli po prawej, jeśli aparat do gradientu zaczyna się od prawej strony; odwrotnie, jeśli ciecz przepływa najpierw od lewej strony)

  • popchnij, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza
    Utrzymuj komorę na prawym mieszaniu
    Kolumna powinna opróżniać się z taką samą szybkością, z jaką przechodzi roztwór

Przeczytaj OD280 każdej z 40 probówek
Wlej z powrotem do właściwej probówki po każdym odczycie